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高度な安定同位体標識技術を利用した高分子量蛋白質の新規動態解析法の開発

公募研究

研究領域動的構造生命科学を拓く新発想測定技術-タンパク質が動作する姿を活写する-
研究課題/領域番号 17H05877
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関大阪大学

研究代表者

宮ノ入 洋平  大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (80547521)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2019-03-31
研究課題ステータス 完了 (2018年度)
配分額 *注記
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2018年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2017年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
キーワードNMR / 安定同位体標識 / 蛋白質動態 / 巨大蛋白質複合体 / 芳香族アミノ酸 / 蛋白質 / 動態 / 高圧・極低温測定 / 蛋白質複合体 / 安定同位体 / 立体構造 / 高圧測定
研究実績の概要

本課題では、独自に開発を進めてきた安定同位体標識技術を駆使して、80-1000 kDaの高分子量蛋白質複合体の動態構造を解析する手法を確立することを目指している。
平成30年度は、まず、核緩和過程を極限まで排除した新型SAILアミノ酸をGroEL, GroESおよびGroES-GroEL複合体に導入するため、安定同位体標識パターンの最適化を行った。特に芳香族アミノ酸の芳香環および脂肪族水素を立体特異的かつ高感度に観測するためフェニルアラニン、チロシンおよびヒスチジンを対象とした。さらに、ロイシンやバリンのメチル基水素についても最適化を行った。例えば、フェニルアラニンのδ位とβ3位の水素のみを検出する場合、対象外の水素はすべて重水素に置換した。それらアミノ酸を分子量82kDaのMSG蛋白質に導入してNMR測定を行ったところ、芳香環および脂肪族水素の1次元スペクトルを短時間で非常に高感度に観測することに成功した。また2次元NMR測定を行うことで、芳香環水素と脂肪族水素間のNOE信号も高感度に観測することが出来た。このことから各NMR信号の帰属も可能となった。ロイシンやバリンのメチル水素に関しては、高感度観測が可能となったが、信号同士の縮重が多く、1次元スペクトルのみでは、信号帰属は困難となることが判明した。
これら結果を踏まえ、新型SAILアミノ酸をGroES, GroELおよびGroEs-GroE複合体に導入した。その結果、各試料についてPhe残基δ位及びζ位の水素を高感度に観測することに成功した。従来の13C-1H相関信号は、低温度下では広幅化してしまい、観測が困難であったが、本手法では、低温状態でも高感度な信号を観測することが可能となり、巨大蛋白質複合体を対象として芳香環回転運動の解析も可能となった。
今後は、縦緩和時間を短縮した高感度かつ高速測定技術の開発が必要となる。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2018 実績報告書
  • 2017 実績報告書
  • 研究成果

    (18件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 2件、 招待講演 9件) 図書 (1件) 備考 (2件)

  • [国際共同研究] Indiana University(米国)

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [国際共同研究] Harvard Medical School(米国)

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [雑誌論文] Perspective: next generation isotope-aided methods for protein NMR spectroscopy2018

    • 著者名/発表者名
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Terauchi Tsutomu、Takeda Mitsuhiro
    • 雑誌名

      Journal of Biomolecular NMR

      巻: 71 号: 3 ページ: 119-127

    • DOI

      10.1007/s10858-018-0198-x

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Isotope-Aided Methods for Biological NMR Spectroscopy: Past, Present, and Future2018

    • 著者名/発表者名
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Takeda Mitsuhiro
    • 雑誌名

      Experimental Approaches of NMR Spectroscopy

      巻: - ページ: 37-61

    • DOI

      10.1007/978-981-10-5966-7_2

    • ISBN
      9789811059650, 9789811059667
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 重水素標識技術を利用した高分子量蛋白質の溶液構造解析法の開発2018

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入洋平
    • 学会等名
      第1回 重水素材料研究会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 安定同位体標識技術を利用した蛋白質動態構造の解析2018

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入洋平
    • 学会等名
      バイオインタラクション研究会 第2回ワークショップ
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 超高磁場溶液NMRによる蛋白質の立体構造・相互作用・動態変化の高分解能解析2018

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入洋平
    • 学会等名
      創薬支援NMR 創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム:BINDS
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] SAIL-NMR法による高分子量蛋白質の動態解析法の開発2018

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入洋平
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Relaxation Optimized SAIL-NMR method for studying structures and dynamics of protein complexes2018

    • 著者名/発表者名
      Yohei Miyanoiri
    • 学会等名
      Frontiers of Multiscale Structural Biology
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Relaxation Optimized SAIL-NMR method for studying structures and dynamics of protein complexes2018

    • 著者名/発表者名
      Yohei Miyanoiri
    • 学会等名
      Frontiers of Multiscale Structural Biology: Order-disorder transitions and dynamic membrane interactions
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Relaxation Optimization using isotope labeling for studying larger proteins by NMR2018

    • 著者名/発表者名
      Yohei Miyanoiri
    • 学会等名
      Symposium on Structure and Folding of Disease related Proteins
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Relaxation Optimization using isotope labeling for studying larger proteins by NMR2017

    • 著者名/発表者名
      Yohei Miyanoiri
    • 学会等名
      The 56th annual meeting of NMR Society of Japan
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] NMRで観る:高度な安定同位体標識技術を利用した高分子量蛋白質の動態構造解析法2017

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入 洋平
    • 学会等名
      第21回 VBLシンポジウム
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 大阪大学蛋白質研究所におけるNMR共用プラットフォームの運用とSAIL-NMR法の新たな展開2017

    • 著者名/発表者名
      宮ノ入 洋平
    • 学会等名
      日本分光学会NMR分光部会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Relaxation-optimized SAIL NMR for structural studies of large proteins2017

    • 著者名/発表者名
      Yohei Miyanoiri
    • 学会等名
      2nd Molecular, Cellular, and Life Sciences 2017
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [図書] Experimental Approaches of NMR Spectroscopy; Isotope-Aided Methods for Biological NMR Spectroscopy: Past, Present, and Future2017

    • 著者名/発表者名
      Kainosho Masatsune、Miyanoiri Yohei、Takeda Mitsuhiro
    • 総ページ数
      636
    • 出版者
      Springer
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [備考] 大阪大学蛋白質研究所先端計測研究室NMR構造解析グループ

    • URL

      http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/apc/nmr/

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] 大阪大学 蛋白質研究所 先端計測研究室

    • URL

      http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/apc/nmr/

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書

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公開日: 2017-04-28   更新日: 2023-03-20  

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