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タンパク質ダイナミクス観測に資する高時空間分解能ESR・IR計測系の開発と応用

公募研究

研究領域動的構造生命科学を拓く新発想測定技術-タンパク質が動作する姿を活写する-
研究課題/領域番号 17H05882
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関神戸大学

研究代表者

木村 哲就  神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2019-03-31
研究課題ステータス 完了 (2018年度)
配分額 *注記
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2018年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
2017年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
キーワード時間分解分光法 / マイクロ流路デバイス / 顕微赤外分光法 / スピンラベルESR / ダイナミクス観察 / マイクロ流体デバイス / ABCトランスポーター / 量子ビーム / 時間分解測定 / ESR分光法 / 顕微赤外吸収分光法 / フォールディング / タンパク質 / ダイナミクス
研究実績の概要

タンパク質の機能発現機構の解明には『機能発現に伴う分子構造変化』を様々な時空間分解能でとらえることが重要である。 本課題では、スピンラベルESRは微細なコンフォメーション変化を0.1 nm 単位で、赤外分光計測は反応に関連する官能基の局所的な化学構造情報を0.001 nmという高空間分解能で得ることができる。これら二つの分光法を分子拡散を基礎としたマイクロ流路ミキサーとを組み合わせることによって、反応の時間分解計測が可能な、汎用性の高い装置を構築した。装置の組み立てと性能評価を行った上で、タンパク質の立体構造形成、複合体形成に伴う構造変化や、機能部位の電子構造・プロトン化状態、そして化学反応の時間変化の解析を行った。加えて、タンパク質の立体構造形成反応および膜タンパク質の反応への応用を目指し、スピンラベル標識試料の調製法を確立した。
(1) 時間分解SL-ESR測定法の確立: 新たに設計をした分子拡散型ミキサーを用いて、100 μs~数十秒までの広い 時間幅の中で反応を停止させることのできる系を構築した。ESR測定用の試料はSL標識する必要がある。タンパク質立体構造研究のためにはモデルタンパク質として4本のヘリックスから構成されるACBP、および、トランスポーターのダイナミクス研究のために膜タンパク質であり、ヘムを輸送基質とするBhuUV-Tについて、距離測定に適したアミノ酸残基を選び、部位特異的変異導入法によりシステインに変異させ、MTSSLという標識試薬によって部位特異的に標識を行った。
(2) 時間分解IR測定用マイクロ流路ミキサーの作製: 化学エッチング処理を行ったステンレススペーサーを2枚のフッ化カルシウム板で挟むことでマイクロ流路を構築し、SPring-8 BL43IRの赤外放射光を用いた顕微鏡に設置し、鉄の還元反応を追跡し、時間分解計測が可能であることを示した。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2018 実績報告書
  • 2017 実績報告書
  • 研究成果

    (23件)

すべて 2019 2018 2017 その他

すべて 国際共同研究 (3件) 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (17件) (うち国際学会 1件、 招待講演 6件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] San Jose State University(米国)

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [国際共同研究] University of Valencia(スペイン)

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [国際共同研究] California Institute of Technology(米国)

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [雑誌論文] Vibrational and Molecular Properties of Mg2+ Binding and Ion Selectivity in the Magnesium Channel MgtE2018

    • 著者名/発表者名
      Kimura Tetsunari、Lorenz-Fonfria Victor A.、Douki Shintaro、Motoki Hideyoshi、Ishitani Ryuichiro、Nureki Osamu、Higashi Masahiro、Furutani Yuji
    • 雑誌名

      The Journal of Physical Chemistry B

      巻: 122 号: 42 ページ: 9681-9696

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.8b07967

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cells2018

    • 著者名/発表者名
      Ryo KOMIYA, Tetsunari KIMURA, Takashi NOMURA, Minoru KUBO, Jiwang YAN
    • 雑誌名

      Journal of Advanced Mechanical Design, Systems, and Manufacturing

      巻: 12 号: 1 ページ: JAMDSM0021-JAMDSM0021

    • DOI

      10.1299/jamdsm.2018jamdsm0021

    • NAID

      130006386864

    • ISSN
      1881-3054
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] マイクロ流路ミキサーを利用したタンパク質の実時間観察2019

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Spectroscopic studies on the transport mechanism of heme ABC transporter.2019

    • 著者名/発表者名
      林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 鍔木基成, 木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光寿命計測によるACBPのフォールディング機構解析2019

    • 著者名/発表者名
      藤井宏一, 松原亮介, 鍔木基成, 木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター; BhuUVの構造変化測定2019

    • 著者名/発表者名
      大西萌, 小堀康博, 城宜嗣, 杉本宏, 鍔木基成, 木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] SPring-8における時間分解分光計測系の構築とタンパク質の分子機構解析への応用2019

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      第38回SPring-8先端利用技術ワークショップ~SPring-8放射光実験の生物・材料・無機化学への応用~
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] タンパク質の化学的ダイナミズム2019

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      第9回K-CONNEX研究会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Real-time measurements of the conformational changes in ABC transporter; BhuUV, revealed by site-directed spin-labeling EPR spectroscopy.2018

    • 著者名/発表者名
      大西萌, 鍔木基成, 小堀康博, 木村哲就
    • 学会等名
      第56回日本生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] Folding dynamics of acyl-CoA binding protein revealed by fluorescence lifetime measurements.2018

    • 著者名/発表者名
      藤井宏一, 鍔木基成, 木村哲就
    • 学会等名
      第56回日本生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] Vibrational analysis for studying ion-protein interactions of a magnesium ion channel, MgtE.2018

    • 著者名/発表者名
      木村哲就, Lorenz-Fonfria, Victor, 道喜慎太郎, 根木秀佳, 石谷隆一郎, 濡木理, 東雅大, 古谷祐詞
    • 学会等名
      第56回日本生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] Membrane proteins in action; Structural and functional dynamics revealed by time-resolved measurements.2018

    • 著者名/発表者名
      Tetsunari Kimura
    • 学会等名
      International congress on pure and applied chemistry (ICPAC) 2018 Langkawi
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター; BhuUVの構造変化の実時間測定2018

    • 著者名/発表者名
      大西萌, 鍔木基成, 小堀康博, 木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学若手フロンティア研究会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光寿命計測によるアシルCoA結合タンパク質のフォールディング機構の研究2018

    • 著者名/発表者名
      藤井宏一, 鍔木基成, 木村哲就
    • 学会等名
      神戸大学若手フロンティア研究会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] 新規リアルタイム観察装置の開発によるタンパク質の分子機構解明への挑戦2018

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      第6回K-CONNEX研究会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 時間分解可視吸収分光測定によるヘム ABC トランスポーターの輸送メカニズム解析2017

    • 著者名/発表者名
      林沙英, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就
    • 学会等名
      第17回日本蛋白質科学会年会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解分光測定による ABC トランスポーターの分子機構解析2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 池本夕佳
    • 学会等名
      第17回日本蛋白質科学会年会,
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] ABCトランスポーターの分子機構解明を目指した時間分解測定法の開発2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就, 林沙英, 大西萌, 城宜嗣, 杉本宏, 小堀康弘, 池本夕佳
    • 学会等名
      第44回生体分子科学討論会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] 時間分解分光法によるABCトランスポーターの輸送とATP加水分解過程の直接観察2017

    • 著者名/発表者名
      木村哲就
    • 学会等名
      日本生物物理学会第54回年会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [備考] 研究室HP

    • URL

      https://tetsukimura-lab.jp

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書

URL: 

公開日: 2017-04-28   更新日: 2019-12-27  

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