| 研究領域 | 植物の生命力を支える多能性幹細胞の基盤原理 |
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| 研究課題/領域番号 |
18H04832
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
北口 哲也 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (60432374)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2019年度)
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| 配分額 *注記 |
8,580千円 (直接経費: 6,600千円、間接経費: 1,980千円)
2019年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2018年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
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| キーワード | 植物ホルモン / 蛍光タンパク質 / 抗体 / プロテインエンジニアリング / センサー |
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| 研究実績の概要 |
ジベレリン（GA）は植物の成長や環境応答を誘引する重要な調節因子として働いている植物ホルモンであるが、生体内のGAの濃度勾配や輸送の機構は未解明な部分が多い。そこで本研究では緑色蛍光タンパク質と抗体を基盤としたGAの濃度変化を検出するプローブ（GA-Flashbody）を開発することを目指した。タンパク質を精製し、より詳細に解析したところ、GA結合に応答して蛍光輝度が約6倍に増加するGA-Flashbodyを獲得することができた。この蛍光プローブの励起スペクトルのピークは498 nm、蛍光スペクトルのピークは510 nmであり、GFPと同様の緑色の蛍光を示した。また濃度依存曲線からGA1、GA3、GA4に対するEC50を算出したところ、その値はそれぞれ30、50、7 nM程度であった。GA受容体 のGAに対する親和性から、数10 nMから数uM程度の濃度範囲でGAが生体内で存在すると推定され、GA-FlashbodyはGA濃度の低い組織での検出により適している。次に、自家蛍光の強い植物細胞に導入する前に動物細胞に導入し、生細胞でイメージングできるかどうかを検討した。HeLa細胞の細胞質と小胞体に発現させ、GA3を添加したところ、小胞体においては輝度上昇したが、細胞質では輝度上昇しなかった。これは、酸化的環境を持つ小胞体内に対して細胞質は還元的環境であり、抗体中のシステイン残基によるジスルフィド結合が十分に形成されず、プローブの機能が制限されているためと考えられた。以上の結果から、今後GA-Flashbodyの細胞内でのフォールディングを改善することで、植物細胞内におけるGA動態を可視化することができるようになると考えられる。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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