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立体構造を基盤にした生合成酵素の探索ならびに機能の解析と改変の新展開

公募研究

研究領域生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学
研究課題/領域番号 19H04652
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関京都大学

研究代表者

藤橋 雅宏  京都大学, 理学研究科, 助教 (10397581)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2021-03-31
研究課題ステータス 完了 (2020年度)
配分額 *注記
7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円)
2020年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2019年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
キーワード結晶構造解析 / 酵素 / ピロリン酸 / テルペン / 立体構造
研究開始時の研究の概要

酵素反応は環境に優しい条件下で進行しますが、狙った反応を進行させる酵素を設計するのは難しいのが実情です。本研究では、酵素の立体構造を基盤に反応の鍵となる部位を見いだし、その情報を基にして酵素のテーラーメード改良や未発見酵素の高効率な探索を行います。
具体的な対象酵素としては、炭素数25個以上の大型のテルペンをプレニル二リン酸から直接合成するLarge-terpene合成酵素、並びにATPの代わりに無機ピロリン酸をリン酸源として用いるリン酸化酵素を考えています。これらの酵素を題材に、目標の化合物を安価・自由に酵素合成で得られる系の確立を目指します。

研究実績の概要

2つの酵素を対象に、立体構造を基盤として酵素のテーラーメード改良と未発見酵素の探索を行い、天然に無い化合物を含む狙った化合物を合成する酵素の取得を目指した。具体的には、(i) ピロリン酸(PPi)依存性リン酸化酵素のリン酸基受容体の改変、(ii) データベース登録済みの立体構造情報を基にした未発見PPi利用酵素の効率的な探索、(iii) C25以上のテルペン類を合成する酵素の反応機構の詳細な解析と機能の改変、に挑戦した。
研究目標 (i)のPPi依存性リン酸化酵素 (PPi-kinase) のリン酸基受容体の改変については、PPi依存性でイノシトールの1位をリン酸化する酵素 (PPi-Ins1K) のイノシトール認識部位に、ATP依存性でイノシトールの3位をリン酸化する酵素 (ATP-Ins3K) のイノシトール認識残基を導入することで、PPi依存性でイノシトールの3位をリン酸化する酵素 (PPi-Ins3K) の構築に成功した。この成果は最近ACS Chem Biol誌に発表した。
研究目標 (ii)のデータベース登録済みの立体構造情報を基にした未発見PPi利用酵素の効率的な探索については、現在は機能未知酵素として登録されている2つの酵素が、PPiを用いて基質Xをリン酸化する酵素であることを確かめた。基質Xをリン酸化するPPi-kinaseは、これまでに発見されていない。
研究目標 (iii) のC25以上のテルペン類を合成する酵素の反応機構の詳細な解析と機能の改変については、Bacillus alcalophilus 由来のClass IB型Large-terpene synthase (Bal-TS)について、活性に必要な金属イオンを含む基質結合型の結晶構造を決定した。これにより基質prenyl二リン酸のリン酸基並びに疎水性鎖の認識機構が明らかになった。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2020 実績報告書
  • 2019 実績報告書
  • 研究成果

    (14件)

すべて 2021 2020 2019

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (12件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Altering the phosphorylation position of pyrophosphate-dependent myo-inositol-1-kinase based on its crystal structure2021

    • 著者名/発表者名
      Tashiro, R., Sato, T., Atomi, H., Miki, K., Fujihashi, M.
    • 雑誌名

      ACS Chem. Biol.

      巻: in press 号: 5 ページ: 794-799

    • DOI

      10.1021/acschembio.0c00733

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Characterization of Class IB Terpene Synthase: The First Crystal Structure Bound with a Substrate Surrogate2020

    • 著者名/発表者名
      Stepanova Rafaella、Inagi Hayato、Sugawara Kei、Asada Kazuya、Nishi Tomoyuki、Ueda Daijiro、Yasuno Yoko、Shinada Tetsuro、Miki Kunio、Fujihashi Masahiro、Sato Tsutomu
    • 雑誌名

      ACS Chemical Biology

      巻: - 号: 6 ページ: 1517-1525

    • DOI

      10.1021/acschembio.0c00145

    • NAID

      120006892058

    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Class IB大型テルペン合成酵素の基質-金属イオン複合体の結晶構造解析2021

    • 著者名/発表者名
      金本壮平, 佐藤努, 品田哲朗, 三木邦夫, 深井周也, 藤橋雅宏
    • 学会等名
      2020年度量子ビームサイエンスフェスタ
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] クラスIB大型テルペン合成酵素の基質複合体の結晶構造解析2020

    • 著者名/発表者名
      金本壮平, 佐藤努, 品田哲朗, 三木邦夫, 深井周也, 藤橋雅宏
    • 学会等名
      第30回イソプレノイド研究会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] クラスⅠ Bテルペン合成酵素の諸性質解析、マイナー生物同定および環化に重要な残基の特定2020

    • 著者名/発表者名
      浅田和也, Rafaella Stepanova, 菅原啓, 西智之, 上田大次郎, 稲木隼人, 三木邦夫, 藤橋雅宏, 保野陽子, 品田哲郎, 佐藤 努
    • 学会等名
      香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] 全自動とリモートでのデータ収集を通したリン位置同定の試み2020

    • 著者名/発表者名
      藤橋雅宏
    • 学会等名
      第5回タンパク質結晶構造解析中級者向け講習会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] クラスIB大型テルペン合成酵素の基質複合体の結晶構造2020

    • 著者名/発表者名
      金本壮平, 佐藤努, 品田哲朗, 三木邦夫, 深井周也, 藤橋雅宏
    • 学会等名
      日本結晶学会 令和2年度年会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] Finding and modifying pyrophosphate-dependent kinases based on crystal structures2020

    • 著者名/発表者名
      Masahiro Fujihashi
    • 学会等名
      KAIST‐Kyoto‐NTHU Junior Chemist Symposium
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Class IB terpene synthase: a minor product having new cyclic skeleton and site-directed mutagenesis of putative active site residue2020

    • 著者名/発表者名
      Rafaella Stepanova, Kazuya Asada, Daijiro Ueda, Hayato Inagi, Kunio Miki, Masahiro Fujihashi, Yoko Yasuno, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato
    • 学会等名
      日本農芸化学会2020年度大会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] 結晶構造を基にした無機ピロリン酸依存性リン酸化酵素の探索2019

    • 著者名/発表者名
      藤橋雅宏
    • 学会等名
      酵素・補酵素研究会2019
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] 立体構造を基盤とした機能改変による新しいピロリン酸依存性キナーゼの創成2019

    • 著者名/発表者名
      田代崚、佐藤喬章、跡見晴幸、三木邦夫、藤橋雅宏
    • 学会等名
      第92回日本生化学会大会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] Class IB 大型テルペン合成酵素の基質認識機構の解析2019

    • 著者名/発表者名
      藤橋雅宏, 稲木隼人, 西智之, 上田大次郎, 佐藤努, 品田哲朗, 三木邦夫
    • 学会等名
      第29回イソプレノイド研究会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] Structural analysis on a new pyrophosphate-dependent kinase reveals its donor selectivity determinants2019

    • 著者名/発表者名
      Ryuhei Nagata, Masahiro Fujihashi, Takaaki Sato, Haruyuki Atomi, Kunio Miki
    • 学会等名
      16th conference of the Asian Crystallographic Association
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Characterization and mutation of class-IB terpene synthase2019

    • 著者名/発表者名
      Rafaella Stepanova, Tomoyuki Nishi, Kei Sugawara, Daijiro Ueda, Hayato Inagi, Kunio Miki, Masahiro Fujihashi, Yoko Yasuno, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato
    • 学会等名
      3rd International Conference on Natural Products Discovery and Development in the Genomic Era
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書

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公開日: 2019-04-18   更新日: 2021-12-27  

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