| 研究領域 | 生物合成系の再設計による複雑骨格機能分子の革新的創成科学 |
|---|
| 研究課題/領域番号 |
19H04655
|
|---|
| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 審査区分 |
理工系
|
|---|
| 研究機関 | 近畿大学 |
|---|
研究代表者 |
梶川 昌孝 近畿大学, 生物理工学部, 講師 (40594437)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
|
| 配分額 *注記 |
7,540千円 (直接経費: 5,800千円、間接経費: 1,740千円)
2020年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2019年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
|
|---|
| キーワード | 分子育種 / エストライド脂質 / 珪藻 / 機能スクリーニング / 分裂酵母 / アクティベーションタギング / 植物代謝工学 / 脂質代謝 / 有用物質生産 / 植物脂質 / 藻類脂質 / ツノケイソウ |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
水酸化脂肪酸に他の脂肪酸がエステル結合した脂質であるエストライドは、化学的、薬理学的に優れた特性をもち、安定的な供給システムの構築が求められる。ツノケイソウは水酸化脂肪酸のリシノール酸をエストライド化してトリアシルグリセロール分子内に蓄積したことから、エストライド化酵素遺伝子をツノケイソウより同定し利用することを目的とする。ツノケイソウの脂質量全体を底上げするために、モデル緑藻の脂質蓄積抑制因子のツノケイソウのオルソログ遺伝子をゲノム編集によって遺伝子破壊する。油糧植物のナガミノアマナズナ種子および油糧酵母においてもエストライド化酵素を発現させ、多角的なエストライド脂質生産の基盤を整える。
|
| 研究実績の概要 |
エストライド脂質は水酸基をもつ脂肪酸に他の脂肪酸が１分子エステル結合して連結した二量体構造を含む脂質である。エストライド脂質の生産と活用のため、ツノケイソウのエストライド化を担う生合成遺伝子を同定することを目的とした。そのため、ツノケイソウのcDNA発現ライブラリーを発現させた分裂酵母を用いた機能スクリーニングを行った。培養温度20℃での振盪培養において、4 mg/mlのリシノール酸を培養液に添加した場合には60日以上完全に生育を抑制することがわかった。cDNAライブラリーを導入した分裂酵母を4 mg/mlのリシノール酸添加条件でバルク培養したところ、38日後に増殖が始まり45日後には定常期まで達した。また細胞からはエストライドTAGが検出された。さらに増殖した細胞はツノケイソウの機能未知の遺伝子が導入されていることがわかった。
ツノケイソウの中性脂質蓄積量の底上げを目的とし、ノケイソウの変異株集団の中から脂質蓄積異常株を探索して新規制御因子の単離を試みた。ツノケイソウで順遺伝学的解析を行うための工夫として高発現プロモーターのゲノムへのランダム挿入によるアクティベーションタギングを用いた。高発現プロモーターとしてツノケイソウの内在性の硝酸還元酵素遺伝子CgNRのプロモーターを用いた。約5,000株の独立した形質転換株を単離し、ナイルレッド蛍光を指標に中性脂質蓄積異常を示す変異株、すなわち野生株と比べて脂質蓄積量の高い株および低い株の両方を選抜した。その結果、ナイルレッド蛍光値、中性脂質蓄積量がともに野生株と比べて約50％まで減少した46C1株が単離された。46C1株ではプロテアーゼドメインをもつ遺伝子の転写開始点上流に導入したプロモーター配列が順向きに挿入されていた。
|
| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
|
