β-TrCPのリン酸化基質への結合に拮抗する小分子探索と蛋白質分解誘導系への応用

• 研究領域: ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア
• 研究課題/領域番号: 19H05302
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 渡邉 信元 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (90221689)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 8,060千円 (直接経費: 6,200千円、間接経費: 1,860千円); 2020年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円); 2019年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
• キーワード: ユビキチン化 / 小分子探索 / タンパク質分解 / タンパク質間相互作用 / タンパク質リン酸化 / PROTAC / Fボックスタンパク質 / 蛍光タンパク質 / ユビキチン

研究開始時の研究の概要

β-TrCP(β-Transducin repeat Containing Protein)は、SCF型E3ユビキチン化酵素の基質認識サブユニットF-BOXタンパク質のひとつであり、基質のリン酸化を認識して結合する。本研究計画では、β-TrCPの基質へのリン酸化依存結合に拮抗する小分子リガンドを見出し、β-TrCPリガンドと細胞内の分解させたい標的タンパク質の特異的リガンドとの結合キメラ化合物を合成し、標的タンパク質を結合キメラ化合物によってプロテアソーム依存分解させるシステムの構築研究を行う。

研究実績の概要

昨年度までの研究で、これまでに代表者が確立してきた、他のタンパク質にリン酸化に依存して結合するタンパク質のリン酸化ペプチドへの結合をハイスループットに測定する探索系の技術を応用して、β-TrCPのリン酸化基質への結合に拮抗する小分子探索系を構築した。具体的には、蛍光タンパク質(monomeric Azami Green; mAG)と融合したβ-TrCP1あるいはβ-TrCP2をバキュロウイルスに導入して昆虫細胞に感染することでこれらの融合タンパク質を大量発現する系を構築した。さらにβ-TrCPの標的リン酸化ペプチドを96穴プレートに共有結合し、上述の感染細胞の細胞抽出液を入れたのちに洗浄し、結合を蛍光プレートリーダーで測定することで、融合タンパク質の結合をハイスループットに測定できることを示した。これらの結果からβ-TrCPの標的への結合阻害物質を直接ハイスループットに探索できる系を計画通り構築できたと結論した。β-TrCPの標的への結合を直接検出する阻害物質探索系はこれが初めての例であり、阻害物質の探索に極めて有効であると考えている。
本年度は、次にこの系の有効性の検証をさらに進めた。β-TrCPの阻害物質は文献上知られているものはほとんど無いが、その一つであるGS143について阻害能の確認を行い、それほど強くはないが(IC50=数十μM)、濃度依存の阻害が確認された。このシステムをもちいて、理研天然物ライブラリー(RIKEN NPDepo Library)の化合物について阻害物質の探索を行った。約５００の物質を探索し、結合を有意に阻害出来る物質を12化合物得ることができた。これらについてその類縁体の解析、Gleevecの融合化合物がBcr-Ablタンパク質のProtacとして機能できる可能性へと研究を進める事への基盤作りに成功した。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] Max Planck Institute(ドイツ)
• [国際共同研究] North East Normal University/Guangzhou Medical University(中国)
• [国際共同研究] Universiti Sains Malaysia(マレーシア)
• [国際共同研究] Max Planck Institute(ドイツ)
• [国際共同研究] North East Normal University(中国)
• [国際共同研究] Universiti Sains Malaysia(マレーシア)
• [雑誌論文] Discovery of a σ1 receptor antagonist by combination of unbiased cell painting and thermal proteome profiling. (2021)
  • 著者名/発表者名: Wilke J, Kawamura T, Xu H, Brause A, Friese A, Metz M, Schepmann D, Wunsch B, Artacho-Cordon A, Nieto FR, Watanabe N, Osada H, Ziegler S, Waldmann H.
  • 雑誌名: Cell Chem Biol 巻: - 号: 6 ページ: 1-7
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.01.009
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A traditional Chinese Medicine, YXQN, Reduces Amyloid-induced Cytotoxicity by Inhibiting Aβ42 Aggregation and Fibril Formation (2020)
  • 著者名/発表者名: Wang Lichun、Liu Sitong、Xu Jiaqi、Watanabe Nobumoto、Di Jun、Wei Wei、Mayo Kevin H.、Li Jiang、Li Xiaomeng
  • 雑誌名: Current Pharmaceutical Design 巻: 26 号: 7 ページ: 780-789
  • DOI: 10.2174/1381612826666200207120602
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Injectable hydrogel-loaded nano-hydroxyapatite that improves bone regeneration and alveolar ridge promotion (2020)
  • 著者名/発表者名: Pan Yongsheng、Zhao Yue、Kuang Rong、Liu Hou、Sun Duo、Mao Tianjiao、Jiang Kexin、Yang Xinting、Watanabe Nobumoto、Mayo Kevin H.、Lin Quan、Li Jiang
  • 雑誌名: Materials Science and Engineering: C 巻: 116 ページ: 111158-111158
  • DOI: 10.1016/j.msec.2020.111158
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Emodin inhibits aggregation of amyloid‐β peptide 1-42 and improves cognitive deficits in Alzheimer's disease transgenic mice (2020)
  • 著者名/発表者名: Wang Lichun、Liu Sitong、Xu Jiaqi、Watanabe Nobumoto、Mayo Kevin H.、Li Jiang、Li Xiaomeng
  • 雑誌名: Journal of Neurochemistry 巻: - 号: 6 ページ: 1992-2007
  • DOI: 10.1111/jnc.15156
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Discovery of small-molecule modulator of heterotrimeric Gi-protein by integrated phenotypic profiling and chemical proteomics (2020)
  • 著者名/発表者名: 16)Kawamura, T., Futamura, Y., Shang, E., Muroi, M., Janning, P., Ueno, M., Wilke, J., Takeda, S., Kondoh, Y., Ziegler, S., Watanabe, N., Waldmann, H., Osada, H.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 84 号: 12 ページ: 2484-2490
  • DOI: 10.1080/09168451.2020.1812375
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] CHAPTER 5. Small Molecule Inhibitors of E3 Ubiquitin Ligases (2020)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Nobumoto、Osada Hiroyuki
  • 雑誌名: Protein-Protein Interaction Regulators 巻: 78 ページ: 109-123
  • DOI: 10.1039/9781788016544-00109
  • ISBN: 9781788011877, 9781839160509, 9781788016544
• [雑誌論文] Measurement of ATPase Activity of Valosin-containing Protein/p97 (2020)
  • 著者名/発表者名: Suvarna Kruthi、Honda Kaori、Muroi Makoto、Kondoh Yasumitsu、Osada Hiroyuki、Watanabe Nobumoto
  • 雑誌名: BIO-PROTOCOL 巻: 10 号: 3
  • DOI: 10.21769/bioprotoc.3516
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of Target Protein for Bio-active Small Molecule Using Photo-cross Linked Beads and MALDI-TOF Mass Spectrometry (2020)
  • 著者名/発表者名: Suvarna Kruthi、Honda Kaori、Muroi Makoto、Kondoh Yasumitsu、Watanabe Nobumoto、Osada Hiroyuki
  • 雑誌名: BIO-PROTOCOL 巻: 10 号: 3
  • DOI: 10.21769/bioprotoc.3517
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A novel inhibitor of tumorspheres reveals the activation of the serine biosynthetic pathway upon mitochondrial inhibition. (2019)
  • 著者名/発表者名: Subedi A, Muroi M, Futamura Y, Kawamura T, Aono H, Nishi M, Ryo A, Watanabe N, Osada H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 593 号: 8 ページ: 763-776
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13361
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 2-Sulfonylpyrimidines target the kinesin HSET via cysteine alkylation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Forster T, Shang E, Shimizu K, Sanada E, Scholermann B, Huebecker B, Hahne G, Lopez-Alberca MP, Janning P, Watanabe N, Sievers S, Giordanetto F, Shimizu T, Ziegler S, Osada H, Waldmann H.
  • 雑誌名: Eur J Org Chem 巻: 2019 号: 31-32 ページ: 5486-5496
  • DOI: 10.1002/ejoc.201900586
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of microplate- and bottle-based methods to age yeast for chronological life span assays. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kwong MMY, Lee JW, Samian MR, Watanabe N, Osada H, Ong EBB.
  • 雑誌名: J Microbiol Methods 巻: 167 ページ: 105743-105743
  • DOI: 10.1016/j.mimet.2019.105743
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] SUMO3 modification by PIAS1 modulates androgen receptor cellular distribution and stability (2019)
  • 著者名/発表者名: Yang Nanyang、Liu Sitong、Qin Tian、Liu Xintong、Watanabe Nobumoto、Mayo Kevin H.、Li Jiang、Li Xiaomeng
  • 雑誌名: Cell Communication and Signaling 巻: 17 号: 1
  • DOI: 10.1186/s12964-019-0457-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Curcumol: From Plant Roots to Cancer Roots (2019)
  • 著者名/発表者名: Wei Wei、Rasul Azhar、Sadiqa Ayesha、Sarfraz Iqra、Hussain Ghulam、Nageen Bushra、Liu Xintong、Watanabe Nobumoto、Selamoglu Zeliha、Ali Muhammad、Li Xiaomeng、Li Jiang
  • 雑誌名: International Journal of Biological Sciences 巻: 15 号: 8 ページ: 1600-1609
  • DOI: 10.7150/ijbs.34716
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Target identification of a small-molecule inhibitor of cancer cell-accelerated fibroblast migration as valosin-containing protein/p97 (2019)
  • 著者名/発表者名: Kruthi Suvarna, Kaori Honda, Makoto Muroi, Yasumitsu Kondoh, Hiroyuki Osada, Nobumoto Watanabe
  • 学会等名: URICAS Symposium 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Small molecule inhibitors of cancer cell-accelerated fibroblast migration and their mechanism of action. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kruthi Suvarna, Kaori Honda, Makoto Muroi, Yasumitsu Kondoh, Hiroyuki Osada, Nobumoto Watanabe
  • 学会等名: RIKEN-Max Planck Joint Research Center for Systems Chemical Biology 7th Annual Symposium.
  • 国際学会 / 招待講演