| 研究領域 | 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計 |
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| 研究課題/領域番号 |
19H05380
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (10546592)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2019年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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| キーワード | 分子機械 / 進化分子工学 / マイクロデバイス / ATPase |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では分子機械の改造・創成を実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術の開発を行う。そのため1DNA隔離、タンパク質発現・精製、機能評価、DNA回収という進化分子工学的スクリーニングプロセスの全てをマイクロチャンバーデバイス内で実現する技術を開発する。これまでの研究から精製以外のプロセスのデバイス実装は完了している。そこで本研究では微小ドロップレット内でのタンパク質精製プロセスを組み込んだスクリーニング技術を確立する。さらに確立したスクリーニング技術を分子機械であるF1-ATPaseのスクリーニングへと拡張させ、分子機械の改造や新規機能の創成への適応を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究では進化分子工学による生体分子の改造・創成を実現する新規スクリーニング技術の開発を目的とする。具体的には1DNA 隔離、タンパク質発現・精製、機能評価、DNA 回収というスクリーニングプロセスをマイクロチャンバーデバイス内で実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術を開発する。本研究が実現すれば、１デバイスあたり数万個～数十万個のライブラリの高精度スクリーニングが一日で可能になる。モデル生体分子としてはATPase を対象とし、ATPを分解して化学エネルギーを力学的エネルギーへと変換する分子機械F1-ATPase の改造や新規機能の創成への適応を目指す。スクリーニングを実現するにはATPase反応のデバイス内での検出が必要になる。そこで前年度に、ATP分解で生じるADP、Piを酵素カップリング反応により蛍光物質へと変換しデバイス内で検出する新規方法を開発し、10分子程度のATPaseの活性を蛍光で検出できることを示した。しかし、サンプルが存在しない場合でも偽陽性の信号が出る問題と、バックグラウンドの蛍光の上昇が大きいという問題が出てきた。そこで本年度は、この計測法の最適化を行った。具体的には、偽陽性信号の原因と考えられた酵素カップリング反応に用いる酵素を全て自前で調製・精製することにより、偽陽性信号の低減を試みた。また溶液の構成要素の検討を行うことで、バックグラウンドの蛍光上昇の低減を試みた。結果、偽陽性信号を1/33に、バックグラウンドの蛍光上昇を1/5に低減することに成功した。さらにこの最適化した実験系により、ATPase１分子のデバイス内検出を実現し、活性の低いATPaseと高いATPaseの活性を区別することにも成功した。これはこの新規検出系を用いることで、活性の高いATPaseをデバイス内でスクリーニング可能であることを示している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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