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人工分子で捉えて観る、タンパク質輸送機械の輸送発動の瞬間

公募研究

研究領域発動分子科学:エネルギー変換が拓く自律的機能の設計
研究課題/領域番号 19H05401
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関京都府立大学

研究代表者

田中 俊一  京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2021-03-31
研究課題ステータス 完了 (2020年度)
配分額 *注記
5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2019年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
キーワードタンパク質輸送装置 / 前駆体タンパク質 / 人工結合タンパク質 / X線結晶構造解析 / タンパク質工学
研究開始時の研究の概要

生物がつくるタンパク質輸送装置は、極めて精巧な生体分子機械である。その動作機序の解明は、新たな分子機械創成の合理的設計指針を与え、ナノバイオテクノロジーの発展に貢献する。
これまでの研究から、タンパク質輸送装置の動作機序に関して多くのことが分かってきた。しかし、「タンパク質輸送装置がその内部で、前駆体タンパク質をどう輸送しているのか?」は、未だ解明に至らないブラックボックスである。
そこで本研究では、研究代表者独自のアプローチによって、前駆体タンパク質が輸送装置の内部を通る瞬間を捕捉し、その構造をX線結晶構造解析によって観察することで、タンパク質輸送装置の動作機序におけるブラックボックスを開く。

研究実績の概要

本研究課題の趣旨は、生体分子機械であるタンパク質輸送装置が、その内部でどのように前駆体タンパク質を輸送しているのか、その動作機序を理解することにある。グラム陰性細菌Serratia marcescensの持つI型タンパク質輸送装置(T1SS)をモデルに、本年度は、(1)タンパク質輸送装置を構成するサブユニット(LipB、LipC、LipD)の単体ならびに複合体の構造機能解析、(2)タンパク質分泌能をリアルタイムで測定するための人工蛍光分子プローブの開発に取り組んだ。
(1)について、LipBの膜貫通領域を含めた状態での高純度タンパク質精製に成功し、さらに、結晶化条件の最適化にも至った。膜貫通二量体としてのモデル構造から、LipBの構造内部にある正電荷クラスターと、前駆体タンパク質に特徴的な負電荷アミノ酸領域との静電的相互作用が、効率的な輸送の原動力となっていることが示唆された。LipDについては、これまで用いてきたBL21(DE3)株やC43(DE3)株の大腸菌ではタンパク質発現効率が低かったため、TolC欠損株を導入し、安定的なタンパク質精製ができるようになった。今後は、LipDの構造解析、LipB-LipC-LipD複合体の構造解析、さらに、前駆体タンパク質をその内部に含んだ状態での複合体の構造解析を進め、タンパク質輸送装置の動作機序についてさらに精緻な知見を得たいと考えている。
(2)について、赤色蛍光タンパク質(mRFP)のタンパク質工学によって、分泌される前の細胞内ではアンフォールディング状態を維持して蛍光を発さず、一方で、分泌された後には直ちにフォールディングが起こって蛍光を発する、新たな人工蛍光分子プローブの開発に成功した。当該プローブを活用することで、今後、タンパク質輸送装置のin vivoでの定量的な機能解析や、進化工学による高機能化が容易になると期待できる。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2020 実績報告書
  • 2019 実績報告書
  • 研究成果

    (13件)

すべて 2021 2020 2019

すべて 雑誌論文 (8件) (うち査読あり 8件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] Dynamic Assembly/Disassembly of Staphylococcus aureus FtsZ Visualized by High-Speed Atomic Force Microscopy2021

    • 著者名/発表者名
      Fujita Junso、Sugiyama Shogo、Terakado Haruna、Miyazaki Maho、Ozawa Mayuki、Ueda Nanami、Kuroda Natsuko、Tanaka Shun-ichi、Yoshizawa Takuya、Uchihashi Takayuki、Matsumura Hiroyoshi
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 22 号: 4 ページ: 1697-1697

    • DOI

      10.3390/ijms22041697

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Revisiting the Rate-Limiting Step of the ANS?Protein Binding at the Protein Surface and Inside the Hydrophobic Cavity2021

    • 著者名/発表者名
      Ota Chikashi、Tanaka Shun-ichi、Takano Kazufumi
    • 雑誌名

      Molecules

      巻: 26 号: 2 ページ: 420-420

    • DOI

      10.3390/molecules26020420

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Spectroscopic Evidence of the Salt-Induced Conformational Change around the Localized Electric Charges on the Protein Surface of Fibronectin Type III2020

    • 著者名/発表者名
      Ota Chikashi、Fukuda Yui、Tanaka Shun-ichi、Takano Kazufumi
    • 雑誌名

      Langmuir

      巻: 36 号: 47 ページ: 14243-14254

    • DOI

      10.1021/acs.langmuir.0c02367

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Insertion loop‐mediated folding propagation governs efficient maturation of hyperthermophilic Tk‐subtilisin at high temperatures2020

    • 著者名/発表者名
      Uehara R., Dan N., Amesaka H., Yoshizawa T., Koga Y.., Kanaya S., Takano K., Matsumura H., Tanaka SI.
    • 雑誌名

      FEBS letters

      巻: 594 号: 4 ページ: 452-461

    • DOI

      10.1002/1873-3468.14028

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Crystal structure of a GH1 β‐glucosidase from Hamamotoa singularis2020

    • 著者名/発表者名
      Uehara Ryo、Iwamoto Riki、Aoki Sayaka、Yoshizawa Takuya、Takano Kazufumi、Matsumura Hiroyoshi、Tanaka Shun‐ichi
    • 雑誌名

      Protein Science

      巻: 29 号: 9 ページ: 2000-2008

    • DOI

      10.1002/pro.3916

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Crystal structures of the cell-division protein FtsZ from Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli2020

    • 著者名/発表者名
      Yoshizawa Takuya、Fujita Junso、Terakado Haruna、Ozawa Mayuki、Kuroda Natsuko、Tanaka Shun-ichi、Uehara Ryo、Matsumura Hiroyoshi
    • 雑誌名

      Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications

      巻: 76 号: 2 ページ: 86-93

    • DOI

      10.1107/s2053230x2000076x

    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Activity-stability trade-off in random mutant proteins2019

    • 著者名/発表者名
      Kurahashi Ryo、Tanaka Shun-ichi、Takano Kazufumi
    • 雑誌名

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      巻: 128 号: 4 ページ: 405-409

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.03.017

    • NAID

      40022037135

    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Spectroscopic Signature of the Steric Strains in an Escherichia coli RNase HI Cavity-Filling Destabilized Mutant Protein2019

    • 著者名/発表者名
      Ota Chikashi、Suzuki Hikari、Tanaka Shun-ichi、Takano Kazufumi
    • 雑誌名

      The Journal of Physical Chemistry B

      巻: 124 号: 1 ページ: 91-100

    • DOI

      10.1021/acs.jpcb.9b09852

    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Mechanical Insights into Large Protein Secretion Mediated by ABC-Tripartite Transporter2020

    • 著者名/発表者名
      Shun-ichi Tanaka, Daichi Murata, Clement Angkawidjaja, Kazufumi Takano
    • 学会等名
      The 1st International Symposium on Molecular Engine
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] Structural insight into the mechanism of Monobody-mediated alteration of enzyme substrate specificity2019

    • 著者名/発表者名
      R. Iwamoto, T. Yoshizawa, R. Uehara, K. Takano, S. Koide, H. Matsumura, S.-i. Tanaka
    • 学会等名
      International Symposium on Diffraction Structure Biology 2019
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Exploration of an Efficient Way to Obtain High Activity Protein by Stability Selection2019

    • 著者名/発表者名
      R. Kurahashi, S.-i. Tanaka, K. Takano
    • 学会等名
      Thermophiles 2019
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 人工結合タンパク質を介したβ-ガラクトシダーゼの基質特異性改変とその分子メカニズムの解明2019

    • 著者名/発表者名
      岩本里樹、吉澤拓也、上原了、高野和文、小出昌平、松村浩由、田中俊一
    • 学会等名
      日本農芸化学会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書
  • [学会発表] Engineering by Proxy: Monobody-mediated alteration of enzyme specificity2019

    • 著者名/発表者名
      S.-i. Tanaka, T. Takahashi, A. Koide, R. Iwamoto, H. Matsumura, T. Yoshizawa, K. Takano, S. Koikeda, S. Koide
    • 学会等名
      日本農芸化学会
    • 関連する報告書
      2019 実績報告書

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公開日: 2019-04-18   更新日: 2021-12-27  

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