| 研究領域 | シンギュラリティ生物学 |
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| 研究課題/領域番号 |
19H05435
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
高里 実 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40788676)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
8,580千円 (直接経費: 6,600千円、間接経費: 1,980千円)
2020年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2019年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
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| キーワード | MET / 腎臓オルガノイド / 1細胞オミックス / iPS細胞 / ヒトiPS細胞 / 分化誘導 / 腎臓前駆細胞 / シンギュラリティー / 腎胞 / 1細胞解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
腎臓発生の過程で、腎臓前駆細胞である腎間葉系前駆細胞は、間葉上皮転換（MET）をすることでネフロンという腎臓の機能を担う上皮構造へと発達する。研究代表者はこれまでの研究で、ヒトiPS細胞から腎間葉系前駆細胞を誘導し、in vitroでMETを発生させる系を開発した。更に、この腎間葉系前駆細胞のMETは、一見均一な細胞から構成される集団内部で、とても低い確率でしか発生しないシンギュラーなイベントであることを突き止めた。本研究計画では、このユニークな上皮化のシンギュラリティイベントの人工発生系を用いて、シンギュラリティイベントの発生を司る環境特異性の実体を解明することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究課題ではその研究目的を達成するために、腎臓オルガノイドにおけるMETイベントのリアルタイムモニタリングの系を構築した上で、機械学習によってライブイメージングで得た画像情報からMETを起こす特異的細胞を含むスフェロイドをprospectiveに同定する手法を確立することとした。その後、同定した特異的細胞を含むスフェロイドを採取し、特異的細胞を含まないスフェロイドと分子生物学的に比較することで、その特異性を解析する。
まずは、腎臓のMETイベントを可視化するために、イベントの最初期に発現する遺伝子WNT4とLHX1を指標とした、WNT4-tdTomatoレポーターiPS細胞株、及びLHX1-AzamiGreenレポーターiPS細胞株を作製する。当年度では、CRISPER/Cas9システムを用いて樹立するために必要なベクターの設計及び作製を完了した。
次に、より小さいサイズの腎臓前駆細胞塊を用いて腎臓オルガノイドを作製し、腎胞を形成するスフェロイドと形成しないスフェロイドが混在する培養条件を見出した。具体的には、細胞塊中の細胞数を様々に変えて、腎胞の発生数を調べた。その結果、100細胞から細胞塊を作製した場合、腎胞が発生した結果生じるネフロンを持つスフェロイドと持たないスフェロイドがおよそ1:1の割合で混在することがわかった。この手法により、細胞塊を最小化し、METが起きるスフェロイドと起きないスフェロイドを混在させ、それらのスフェロイドをライブイメージングに適した条件下で培養することが可能になった。また、これらスフェロイドの具体的な回収方法を検討した。結果、約1000個のスフェロイドを回収し、900 ngのRNAが得られた。これは、トランスクリプトーム解析に十分なRNA収量であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、METイベントを可視化するためのレポーター細胞株の作製を進行している。ベクター構築が完了し、現在細胞株を樹立中である。また、次年度のRNA-seq解析に必要なオルガノイドの培養条件を整えることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製済のベクターを基に、CRISPER/Cas9システムを用いてWNT4-tdTomatoレポーターiPS細胞株、及びLHX1-AzamiGreenレポーターiPS細胞株を樹立する（進行中）。Wild typeのヒトiPS細胞での検討は済んでいるため、同じ条件をレポーターiPS細胞株にも適応できるかを確認し、腎胞の発生を伴う最小の細胞数を見出す。
次に、レポーターiPS細胞株を用いてライブイメージングを行う。そのデータをもとに機械学習を行い、METを起こす特異的細胞を含むスフェロイドをprospectiveに同定する。prospectiveに同定した特異的細胞を含むと思われるスフェロイド、及び特異的細胞を含まないと思われるスフェロイドを採取して、RNA-seqによりトランスクリプトームを比較する。
更に、トランスクリプトームデータを解析し（例えば特異的細胞において、より高発現しているリガンド受容体ペアを見出す）、METイベントの特異性を担う因子を同定する。得られた知見を用い、実際にネフロンの形成数を人工的に制御できるかどうかを確認する。
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