蛍光プローブを活用した活性イオウ分子産生酵素の阻害剤の探索/創製と機能解析

• 研究領域: 化学コミュニケーションのフロンティア
• 研究課題/領域番号: 20H04767
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 慶應義塾大学 (2021); 東京大学 (2020)
• 研究代表者: 花岡 健二郎 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (70451854)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 中途終了 (2021年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2021年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円); 2020年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
• キーワード: 薬学 / 分析科学 / 生体分子 / 分子認識 / 有機化学

研究開始時の研究の概要

本研究において、依然として生物学研究において十分に実用な阻害剤が開発されていないCSE(cystathionine γ-lyase)及びCBS(cystathionine β-synthase)の選択的な阻害剤の開発を、独自に開発してきた活性イオウ分子を検出する蛍光プローブを用いて行う。さらに、開発した阻害剤を培養細胞へと応用することで、生細胞におけるこれら酵素の活性イオウ分子(H2Sを含む)の産生に関わる役割を明らかにする。

研究実績の概要

本研究課題では、近年注目されている活性硫黄分子種の産生酵素として報告されているCSE(cystathionine γ-lyase)及びCBS(cystathionine β-synthase)の選択的阻害剤を独自に開発した蛍光プローブを用いて探索することを目指す。それによって、CSE及びCBSのH2Sを含む活性硫黄分子種の産生に関わる生細胞内での役割の解明に貢献していく。これまでに、同一領域の前回の公募研究にて、独自の蛍光プローブを用いた阻害剤のハイスループットスクリーニングによって、新たなCSE阻害剤を見出すことに成功している。さらに、見出したCSE阻害剤のin vitroでの阻害活性や阻害メカニズムをX線結晶解析やMD計算を用いることで明らかにしている。さらに令和2年度は、開発したCSE選択的阻害剤の特性を更に精査すると共に、培養細胞(HEK283T細胞)へと応用し、開発した阻害剤が細胞膜透過性を持ち、生細胞においても細胞内のCSEの酵素活性を阻害することが可能であることを明らかにした。
令和3年においては、新たにCBSの選択的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを行うために、CBS蛋白質の大腸菌による大量発現を行うと共に、CBSの酵素基質であるシステイン及びホモシステインが高濃度に存在する場合においても低いバックグランド蛍光を示す、新たな阻害剤スクリーニング用の蛍光プローブの開発を行った。さらにそれを用いて阻害剤のハイスループットスクリーニングを行い、CBSに高い選択性を示す新たな阻害剤の開発に成功した。今後、本阻害剤の誘導体化によるCBS阻害活性の向上や生細胞でのCBS阻害剤の阻害活性の評価などを行っていく予定である。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] Massachusetts General Hospital/Indiana University School of Medicine(米国)
• [国際共同研究] Massachusetts General Hospital(米国)
• [国際共同研究] The German Cancer Research Center(ドイツ)
• [雑誌論文] Establishment of live-cell-based coupled assay system for identification of compounds to modulate metabolic activities of cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Yanagi Kouichi、Komatsu Toru、Ogihara Shusuke、Okabe Takayoshi、Kojima Hirotatsu、Nagano Tetsuo、Ueno Tasuku、Hanaoka Kenjiro、Urano Yasuteru
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 36 号: 1 ページ: 109311-109311
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109311
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Sulfide catabolism ameliorates hypoxic brain injury. (2021)
  • 著者名/発表者名: Marutani E, Morita M, Hirai S, Kai S, Grange RMH, Miyazaki Y, Nagashima F, Traeger L, Magliocca A, Ida T, Matsunaga T, Batten A, Li R, Tanaka T, Ikeda T, Nakagawa A, Atochin DN, Ihara H, Olenchock BA, Shen X, Nishida M, Hanaoka K, Kevil CG, Xian M, Bloch DB, Akaike T, Hindle AG, Motohashi H, Ichinose F, et al.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 号: 1 ページ: 3108-3108
  • DOI: 10.1038/s41467-021-23363-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Matrix metalloprotease-14 is a target enzyme for detecting peritoneal metastasis in gastric cancer (2021)
  • 著者名/発表者名: Soichiro Ogawa, Hidemasa Kubo, Yasutoshi Murayama, Takeshi Kubota, Masayuki Yubakami, Tatsuya Matsumoto, Takuma Ohashi, Kazuma Okamoto, Yugo Kuriki, Kenjiro Hanaoka, Yasuteru Urano, Eigo Otsuji
  • 雑誌名: Photodiagnosis Photodyn. Ther. 巻: 35 ページ: 102420-102420
  • DOI: 10.1016/j.pdpdt.2021.102420
  • 査読あり
• [雑誌論文] Design, synthesis and evaluation of enzyme-responsive fluorogenic probes based on pyridine-flanked diketopyrrolopyrrole dyes (2021)
  • 著者名/発表者名: Jenni Sebastien、Ponsot Flavien、Baroux Pierre、Collard Lucile、Ikeno Takayuki、Hanaoka Kenjiro、Quesneau Valentin、Renault K?vin、Romieu Anthony
  • 雑誌名: Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 巻: 248 ページ: 119179-119179
  • DOI: 10.1016/j.saa.2020.119179
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Recent advances in detection, isolation, and imaging techniques for sulfane sulfur-containing biomolecules (2021)
  • 著者名/発表者名: Honami Echizen, Eita Sasaki, Kenjiro Hanaoka
  • 雑誌名: Biomolecules 巻: 11 号: 11 ページ: 1553-1553
  • DOI: 10.3390/biom11111553
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Recent advances in probe design to detect reactive sulfur species and in the chemical reactions employed for fluorescence switching (2021)
  • 著者名/発表者名: Echizen Honami、Hanaoka Kenjiro
  • 雑誌名: Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ 巻: 68 号: 1 ページ: 9-17
  • DOI: 10.3164/jcbn.20-18
  • NAID: 130007965276
  • ISSN: 0912-0009, 1880-5086
  • 査読あり
• [雑誌論文] 超硫黄分子を検出するための蛍光プローブ開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐々木栄太, 花岡健二郎
  • 雑誌名: 生化学 巻: 93 ページ: 604-612
• [雑誌論文] Development of a small-molecule-based activatable photoacoustic probe (2021)
  • 著者名/発表者名: Ikeno Takayuki, Hanaoka Kenjiro, Urano Yasuteru
  • 雑誌名: Methods in Enzymology 巻: 657 ページ: 1-19
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2021.06.041
  • ISBN: 9780323855303
• [雑誌論文] A cytosolically localized far-red to near-infrared rhodamine-based fluorescent probe for calcium ions (2020)
  • 著者名/発表者名: Numasawa Koji、Hanaoka Kenjiro、Ikeno Takayuki、Echizen Honami、Ishikawa Tomoe、Morimoto Masakazu、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Ikegaya Yuji、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • 雑誌名: The Analyst 巻: 145 号: 23 ページ: 7736-7740
  • DOI: 10.1039/d0an01739f
  • 査読あり
• [学会発表] 新規蛍光団の創製を基盤とした 蛍光プローブの開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: 第42回 光化学若手の会
  • 招待講演
• [学会発表] 活性硫黄分子種を検出する蛍光プローブの開発とその応用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: 生理研研究会2021 生命を支える硫黄生物学の最前線
• [学会発表] 蛍光プローブを活用した活性イオウ分子産生酵素の阻害剤の探索/創製と機能解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: 新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」合同会議
• [学会発表] Development of a series of pH ratiometric fluorescence probes and their application to endosomal pH measurements (2021)
  • 著者名/発表者名: Kenjiro Hanaoka
  • 学会等名: PACIFICHEM2021
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Development of a pH ratiometric fluorescence probe for in vivo imaging and its biological applications (2021)
  • 著者名/発表者名: Kenjiro Hanaoka
  • 学会等名: PACIFICHEM2021
  • 国際学会
• [学会発表] Development of a fluorescence probe for H2S and its application to inhibitor screening for H2S/sulfane sulfur-producing enzymes (2021)
  • 著者名/発表者名: Kenjiro Hanaoka
  • 学会等名: PACIFICHEM2021
  • 国際学会
• [学会発表] 疾患組織を特異的に可視化する蛍光プローブの開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: 自治医科大学 病理学セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 活性硫黄種を検出する蛍光プローブの開発と産生酵素の阻害剤スクリーニングへの応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: フォーラム2020：衛生薬学・環境トキシコロジー
  • 招待講演
• [学会発表] 活性硫黄分子の産生酵素に対する選択的阻害剤の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
  • 招待講演
• [図書] ファルマシア 「最前線」 (2021)
  • 著者名/発表者名: 花岡 健二郎
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 公益社団法人日本薬学会
• [備考] 慶應義塾大学 薬学部 創薬分析化学講座
  • URL: http://keio-analchem.jp/index.html
• [備考] 東京大学 大学院薬学系研究科 薬品代謝化学教室
  • URL: http://taisha.f.u-tokyo.ac.jp/index.html