脊椎動物の全胚全細胞ライブ追跡と再構成による骨格形成多様性の解明

• 研究領域: 細胞社会ダイバーシティーの統合的解明と制御
• 研究課題/領域番号: 20H05038
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 齋藤 卓 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60588705)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円); 2021年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円); 2020年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
• キーワード: バイオイメージング / 蛍光イメージング / メダカ / 光学顕微鏡 / 画像解析 / 数理生物学 / 統計解析

研究開始時の研究の概要

生きたまま動物を1細胞レベルで網羅的に解析する新たな方法論の構築は，細胞社会多様性の理解に大きく貢献すると期待される．本研究では，数理的手法を利用してイメージング技術を発展させることによって，これまで生体計測上の技術的な理由から困難であった脊椎動物発生での全細胞ライブ追跡に挑戦する．さらに形態特徴に基づき細胞アノテーションを行う数理解析法を開発，骨格形成異常を有するメダカ変異体へ応用し，中軸骨格発生における細胞社会多様性の解明に繋げる．

研究実績の概要

本研究では、メダカ胚を観察対象として、その全身を細胞レベルの分解能でかつ低光毒性での計測が可能なライトシート顕微鏡の開発を行い、細胞の網羅的かつ経時的イメージングが可能なシステムの構築を目標とした。まず、広視野・高分解能２光子励起ライトシート顕微鏡の開発を行った。これまで2光子励起のライトシート顕微鏡への利用には励起範囲（ライトシート顕微鏡では視野範囲）の狭さが問題となっていた。本研究ではこの問題を解決するために、レーザー集光範囲を光軸方向に伸長するベッセルビームを用いて広視野化を実現した顕微鏡システムを構築した。拡大率10倍NA0.3の対物レンズを用いた場合に、軸方向分解能を2-3μmに保ったままビーム長1000μmを達成し、従来技術(視野範囲600μm，分解能2μm)からの改善を果たし、その成果を国際科学誌（Takanezawa et al, Nat Commun 12:2979, 2021）にて発表した。さらにこの光学系の拡張を進めて、ライトシート顕微鏡による多視点蛍光３D計測と光投影トモグラフィ法の実現を果たし、計画した細胞の網羅的蛍光計測と明視野計測が可能なシステム構築を達成した。長期間に渡るライブイメージングとして，リンパ管発生過程の観察を行った。発生を阻害せずに3日間に渡るタイムラプスイメージングに成功した。さらに骨形態過程における網羅的細胞観察のために細胞核がGFPで標識されたTG系統を確立し、椎骨の弯曲癒合が見られるメダカ変異体における細胞多様性解析を進めた。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Wide field light-sheet microscopy with lens-axicon controlled two-photon Bessel beam illumination (2021)
  • 著者名/発表者名: Takanezawa Sota、Saitou Takashi、Imamura Takeshi
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 号: 1 ページ: 2979-2979
  • DOI: 10.1038/s41467-021-23249-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 次世代バイオイメージング実現のための技術開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 今村健志，川上良介，齋藤卓
  • 雑誌名: OPTRONICS 巻: 480 ページ: 93-98
• [雑誌論文] 生きたままの生物を長期間観察できる２光子励起光シート顕微鏡の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 齋藤卓，高根沢聡太，今村健志
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 39 ページ: 3055-3058
• [雑誌論文] 生きたままの生物を長期間観察できる広視野・高分解能２光子励起ライトシート顕微鏡 (2021)
  • 著者名/発表者名: 齋藤卓，高根沢聡太，今村健志
  • 雑誌名: 光技術コンタクト 巻: 59 ページ: 38-44
• [雑誌論文] Donor-acceptor-acceptor-type near-infrared fluorophores that contain dithienophosphole oxide and boryl groups: Effect of the boryl group on the nonradiative deca (2021)
  • 著者名/発表者名: Yoshiaki Sugihara, Naoto Inai, Thomas Baumgartner, Ryosuke Kawakami, Takashi Saitou, Takeshi Imamura, Masayasu Taki, Takeshi Yanai, Shigehiro Yamaguchi
  • 雑誌名: Chemical Science 巻: - 号: 18 ページ: 6333-6341
  • DOI: 10.1039/d1sc00827g
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A novel regulatory mechanism against BMP/Smad signaling by Smurf2 in bone (2020)
  • 著者名/発表者名: Junichi Kushioka, Takashi Kaito, Rintaro Okada, Hiroyuki Ishiguro, Zeynep Bal, Joe Kodama, Ryota Chijimatsu, Melanie Pye, Masahiro Narimatsu, Jeffrey Wrana, Yasumichi Inoue, Hiroko Ninomiya, Shin Yamamoto, Takashi Saitou, Hideki Yoshikawa, Takeshi Imamura
  • 雑誌名: Bone Research 巻: 8 号: 1 ページ: 41-41
  • DOI: 10.1038/s41413-020-00115-z
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 広視野２光子励起ライトシート顕微鏡のライブイメージングへの応用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 齋藤卓，今村健志
  • 学会等名: レーザー学会学術講演会第４２回年次大会
  • 招待講演
• [学会発表] 広視野型２光子励起ライトシート顕微鏡の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 齋藤卓，今村健志
  • 学会等名: 第３０回日本バイオイメージング学学術集会
• [学会発表] 2光子励起ライトシート顕微鏡の開発とin vivo細胞解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 齋藤卓
  • 学会等名: 第６回細胞ダイバース公開シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Wide Field Light-Sheet Microscopy with Lens-axicon Controlled Two-photon Bessel Beam Illumination (2021)
  • 著者名/発表者名: Takashi Saitou
  • 学会等名: Virtual TGFβ meeting
  • 国際学会
• [備考] 生きたままの生物を長期間観察できる新しい顕微鏡技術の開発
  • URL: https://www.ehime-u.ac.jp/data_relese/data_relese-160294/