| 研究領域 | 細胞社会ダイバーシティーの統合的解明と制御 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05041
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
川又 理樹 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (80602549)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
2021年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
2020年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
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| キーワード | Lineage tracing / DNA barcode / CRISPR-Cas9 / ゲノム編集 / Rainbow / ES細胞 / 肝臓 / lineage tracing / Brainbow / heterogeneity / liver |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では次世代型「ゲノム編集細胞の蛍光＋DNAバーコード二重標識技術」を開発し、細胞培養下やマウス個体において1細胞レベルでリアルタイムなゲノム編集細胞の表現型解析を試みる。特に肝臓は多様な倍数性を持つ肝細胞で構成されているため、マウス肝臓における組織ダイバーシティーが組織再生やがん発症にどのように振る舞うかなど、これまで見いだすことができなかった新しいメカニズムや起源細胞の同定を行う。
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| 研究実績の概要 |
組織や臓器の構築原理、がんなどのさまざまな疾患発症のメカニズムの解明に大きな貢献を果たす新規Lineage tracing技術の開発を研究期間内に行った。CRISPR-Cas9によるDNA二本鎖切断とindel変異誘導メカニズムを利用し、3色(mOrange2, EGFP, mKate2)の蛍光カセットが均等に分配され、且つ、同一蛍光細胞でも異なるindel (DNA barcode)により1細胞レベルでの識別が可能になる二重標識技術の開発に成功した。この最適条件の検討には、独自のCas9活性調節技術を使用すると同時に、各蛍光カセットの両サイドに設置したgRNAのターゲット配列ユニットを複数設定し、DNA二本鎖切断による蛍光カセットの切り落としパターンとindel barcode挿入パターンに多様性が生まれるよう工夫した。更に、CAGプロモーター直下に挿入されるindelがプロモーター配列を改変させることによって、蛍光カセットの発現量が変動し、蛍光強弱の勾配が生じることで同色間においてもクローンの識別が可能となった。つまり、このbarcodeを「見える化」できた蛍光標識によって、特殊な蛍光顕微鏡を用いずともin vitroでは20種類以上のクローンの挙動(増殖性・位置関係)の継時解析が可能となり、in vivoにおいてもテラトーマ内の各種3胚葉分化組織と由来クローンとの関係を明確にするなど、幹細胞の組織構築機序の解明等に有効なツールになり得ることを示した。以上、既存のRainbowシステムの大幅な改良となるGradation Rainbow二重標識システムが、マクロ（位置情報）とミクロ(1細胞)の解析を可能とする次世代型のlineage tracing法として有用であることを実証した。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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