| 研究領域 | マルチモードオートファジー：多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05343
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
西田 友哉 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10581449)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | オートファジー / インスリン分泌顆粒 / 膵β細胞 / 糖尿病 / ゲノムワイドスクリーニング / インスリン / リソソーム / クリノファジー / ユビキチン・プロテアソーム / CRISPR |
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| 研究開始時の研究の概要 |
マクロオートファジーに関する研究が近年目覚ましい進歩を遂げている一方、内分泌細胞でのリソソームを介したホルモン分泌顆粒分解に関しては不明な点が多い。本研究では、糖代謝の中心的な役割を担うインスリンを分泌する膵β 細胞において、蛍光レポーターによりインスリン分泌顆粒分解を空間的・時間的にモニタリングする手法を確立し、その分子メカニズムと病態生理学的意義を明らかにする。さらに、糖尿病モデルマウスを用いて、耐糖能異常におけるインスリン分泌顆粒分解機構の変化に関して解析する。これらの知見を組み合わせ、インスリン分泌顆粒分解機構への介入による糖尿病治療の開発への道筋を拓く。
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| 研究実績の概要 |
今年度の研究においては、(1)インスリン分泌顆粒分解の適切な誘導条件の検討(2)インスリン分泌顆粒分解レポーターの作成、および(3)CRISPR/Cas9システムによる高効率ゲノム編集Cas9発現膵β細胞株のクローニングを実施した。最終的にインスリン分泌顆粒分解制御因子をゲノムワイドスクリーニングによって同定することを目標とした。
はじめに、クローニングにより樹立したCas9発現MIN6細胞を使用し、既知のマクロオートファジー遺伝子がインスリン分泌顆粒分解にどのように関与しているかについて検討を行った。Atg遺伝子の機能グループに応じて、(1)Ulk1複合体(2)PI3K複合体(3)Atg9複合体(4)Atg5-12複合体に関して、構成分子のノックアウト細胞を作成した。それらをグルコース飢餓刺激後、ウェスタンブロットによるプロインスリン・クロモグラニンAの定量、さらにインスリン分泌顆粒分解レポーターによるインスリン分泌顆粒分解の定量により評価した。
その結果、いずれの複合体の構成因子のノックアウトによってもインスリン分泌顆粒分解は阻害されず、マクロオートファジーの制御機構のインスリン分泌顆粒分解への関与は乏しいものと考えられた。
次に、Cas9およびインスリン分泌顆粒分解レポーターを発現したMIN6細胞にゲノムワイドgRNAを導入して飢餓刺激を行い、EGFPの減弱が阻害される、すなわち分泌顆粒分解が阻害されていると考えられる細胞群をフローサイトメトリーにて濃縮し、次世代シークエンスによって解析した。
現在、それらの結果に基づき、インスリン分泌顆粒分解の制御因子の同定を行っている。候補となる遺伝子のノックアウトMIN6細胞を作成してその妥当性を確認し、機能解析に進むことを計画している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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