| 研究領域 | 多様かつ堅牢な細胞形質を支える非ゲノム情報複製機構 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05379
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
松崎 仁美 筑波大学, 生命環境系, 助教 (50436242)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
8,320千円 (直接経費: 6,400千円、間接経費: 1,920千円)
2021年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2020年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
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| キーワード | DNAメチル化 / ゲノム刷り込み / エピジェネティクス / 非対称性DNAメチル化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
哺乳類では、一部の遺伝子の発現が、父・母由来アリルの一方のみであることが正常発生に必須である（ゲノム刷り込み）。同現象は、刷り込み遺伝子座の非対称性（アリル特異的）DNAメチル化によって引き起こされ、その破綻はヒトの疾患の原因となる。本研究は、アリル特異的DNAメチル化の上位階層に位置し、その安定維持に必要な未知のエピゲノム修飾と、同修飾の確立・維持を担う分子の解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
哺乳類では、両親の生殖細胞から異なるパターンのエピゲノム情報が子に受け継がれ、これにより一部遺伝子のアレル間で異なる発現調節を行うゲノム刷り込み現象が知られている。一般的には、同現象の継世代エピゲノム情報はDNAメチル化と考えられているが、我々は先行研究において、Igf2/H19刷り込み遺伝子座のH19-ICR配列においては、さらに上位階層の(DNAメチル化以外の)生殖細胞由来エピゲノム修飾も存在し、受精後初期胚におけるアレル特異的DNAメチル化パターンの維持を担うことを見出した。
本研究では、同修飾の制御因子をenChIP法によって探索するために、FLAG-HAタグ付加dCas9タンパク質と、H19-ICRを認識するガイドRNAの発現ユニットを、導入遺伝子の高発現が見込まれるROSA26 locusに挿入したノックインマウスを作製した。同マウスの解析を進めたが、期待に反してdCas9/gRNAの発現量が不十分であり、H19-ICR上で形成される複合体の精製回収は困難であることが判明した。そこで結合因子の探索を、細胞核抽出液のカラムクロマトグラフィー分画とH19-ICR配列を用いたゲルシフト解析を組み合わせた生化学的方法に変更した。これにより、H19-ICRのメチル化制御コア配列に結合するタンパク質を複数同定した。これらを候補制御タンパク質とし、遺伝子ノックアウトマウスの作製を行い、機能の検証を進めている。
並行して、ゲノム編集によりH19 ICR配列をマウス内在遺伝子座において反転させる実験も行った。その結果、H19遺伝子プロモーターのDNAメチル化は低下したが、父由来H19 ICR自体は野生型と同様に高メチル化を維持していた。したがって、H19 ICRに結合してメチル化を維持する因子は、H19 ICR周辺の配列とは独立して機能することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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