非ゲノム情報による複製開始点制御の解明

• 研究領域: 多様かつ堅牢な細胞形質を支える非ゲノム情報複製機構
• 研究課題/領域番号: 20H05396
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 鐘巻 将人 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 教授 (20444507)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 8,320千円 (直接経費: 6,400千円、間接経費: 1,920千円); 2021年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2020年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
• キーワード: DNA複製 / 複製開始領域 / デグロン / ゲノムDNA / 複製開始点 / オーキシンデグロン

研究開始時の研究の概要

哺乳動物細胞のDNA複製開始点は非ゲノム情報による制御を受けると考えられるが、全ゲノムレベルにおける高解像度マッピングに至っていない。申請者は改良型オーキシンデグロン（AID）法を利用して、DNAリガーゼを迅速に分解除去する実験系を開発した。DNA ligase除去により複製中間体が蓄積するため、これを回収してシーケンスすることにより複製開始点を同定し、非ゲノム情報との相関性を解明する。

研究実績の概要

DNA複製と非ゲノム情報複製は密接に関連している。これまでDNA複製の研究は出芽酵母が真核細胞のモデルとして研究が進展してきたが、出芽酵母においてはDNA配列が複製開始領域を規定している。一方で、哺乳動物細胞を含む多くの生物では、複製開始領域にコンセンサス配列は見当たらず、染色体構造や非ゲノム情報が複製開始領域を規定しているようである。しかしながら、現在までヒト細胞において高精度の複製開始領域は同定できていない。
複製開始領域および複製フォークの向きを同定するには、ラギング鎖上に生じる岡崎フラグメントを回収して、シーケンスすることにより可能である。この目的のために、ヒトHCT116細胞の岡崎フラグメント連結に関与するDNAリガーゼLIG1とLIG3を改良型オーキシンデグロン法AID2で分解除去可能な細胞を作成した。この細胞においては、分解誘導リガンドを添加することにより、細胞内のLIG1およびLIG3を枯渇させ、細胞内に岡崎フラグメントを蓄積させることができる。この細胞を非同調および同調培養を組み合わせて、S期において２時間毎の全ゲノムにおける複製開始領域および複製フォークの移動を検出することに成功した。
その結果、S期初期におよそ50kbp以下の解像度で複製開始領域を同定し、これらの多くは転写されている遺伝子のプロモーターに見つかった。S期中期から後期にかけては、明確な複製開始領域は減っていき、次第にヘテロクロマチン領域が複製された。その際には、複製フォークはユークロマチン領域から進行していることが観察された。しかしながら、複製フォークのスピードからヘテロクロマチン領域においても、不明確な複製開始が散発して、複製を遂行していることが予想された。現在、転写と複製開始領域の関連性に関して、どのようなメカニズムで複製開始領域が規定されるのか、詳細な解析を継続している。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] University of Dundee/University of Aberdeen(英国)
• [国際共同研究] Florida State University/San Diego Biomedical Research Institute(米国)
• [雑誌論文] Ligand-induced degrons for studying nuclear functions (2022)
  • 著者名/発表者名: Masato T Kanemaki
  • 雑誌名: Current Opinion in Cell Biology 巻: 72 ページ: 29-36
  • DOI: 10.1016/j.ceb.2021.12.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] The auxin-inducible degron 2 (AID2) system enables controlled protein knockdown during embryogenesis and development in Caenorhabditis elegans (2022)
  • 著者名/発表者名: Negishi T, Kitagawa S, Horii N, Tanaka Y, Haruta N, Sugimoto A, Sawa H, Hayashi KI, Harata M, Kanemaki MT.
  • 雑誌名: Genetics 巻: 220 号: 2
  • DOI: 10.1093/genetics/iyab218
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Targeted Protein Depletion Using the Auxin‐Inducible Degron 2 (AID2) System (2021)
  • 著者名/発表者名: Saito Yuichiro、Kanemaki Masato T.
  • 雑誌名: Current Protocols 巻: 1 号: 8 ページ: 1-21
  • DOI: 10.1002/cpz1.219
  • 査読あり
• [雑誌論文] SLFN11 promotes stalled fork degradation that underlies the phenotype in Fanconi anemia cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Yusuke、Abe Masako、Mu Anfeng、Tempaku Yasuko、Rogers Colette B.、Mochizuki Ayako L.、Katsuki Yoko、Kanemaki Masato T.、Takaori-Kondo Akifumi、Sobeck Alexandra、Bielinsky Anja-Katrin、Takata Minoru
  • 雑誌名: Blood 巻: 137 号: 3 ページ: 336-348
  • DOI: 10.1182/blood.2019003782
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Ran-GTP Is Non-essential to Activate NuMA for Mitotic Spindle-Pole Focusing but Dynamically Polarizes HURP Near Chromosomes (2021)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya Kenta、Hayashi Hisato、Nishina Momoko、Okumura Masako、Sato Yoshikatsu、Kanemaki Masato T.、Goshima Gohta、Kiyomitsu Tomomi
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 31 号: 1 ページ: 115-127.e3
  • DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.091
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analysis of disease model iPSCs derived from patients with a novel Fanconi anemia-like IBMFS ADH5/ALDH2 deficiency. (2021)
  • 著者名/発表者名: Anfeng Mu, Asuka Hira, Akira Niwa, Mitsujiro Osawa, Kenichi Yoshida, Minako Mori, Yusuke Okamoto, Kazuko Inoue, Keita Kondo, Masato T. Kanemaki, Tomonari Matsuda, Etsuro Ito, Seiji Kojima, Tatsutoshi Nakahata, Seishi Ogawa, Keigo Tanaka, Keitaro Matsuo, Megumu K. Saito, Minoru Takata.
  • 雑誌名: Blood 巻: 137 号: 15 ページ: 2021-2032
  • DOI: 10.1182/blood.2020009111
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Replication timing maintains the global epigenetic state in human cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Klein Kyle N.、Zhao Peiyao A.、Lyu Xiaowen、Sasaki Takayo、Bartlett Daniel A.、Singh Amar M.、Tasan Ipek、Zhang Meng、Watts Lotte P.、Hiraga Shin-ichiro、Natsume Toyoaki、Zhou Xuemeng、Baslan Timour、Leung Danny、Kanemaki Masato T.、Donaldson Anne D.、Zhao Huimin、Dalton Stephen、Corces Victor G.、Gilbert David M.
  • 雑誌名: Science 巻: 372 号: 6540 ページ: 371-378
  • DOI: 10.1126/science.aba5545
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice (2020)
  • 著者名/発表者名: Yesbolatova Aisha、Saito Yuichiro、Kitamoto Naomi、Makino-Itou Hatsune、Ajima Rieko、Nakano Risako、Nakaoka Hirofumi、Fukui Kosuke、Gamo Kanae、Tominari Yusuke、Takeuchi Haruki、Saga Yumiko、Hayashi Ken-ichiro、Kanemaki Masato T.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 号: 1 ページ: 5701-5701
  • DOI: 10.1038/s41467-020-19532-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 特異的タンパク質分解法AID2を利用してゲノムDNAと非ゲノム情報複製の関係を探る (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 日本遺伝学会第93回大会
  • 招待講演
• [学会発表] 植物の力を利用したマウスにおける迅速なタンパク質分解 (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 第80回日本癌学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] 改良型オーキシンデグロンAID2法を利用してヒト細胞DNA複製の謎を探る (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 3Rワークショプ
• [学会発表] ユビキチン・プロテアソーム系を利用した、細胞および動物個体における迅速タンパク質発現制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] 植物が持つ能力を生かした標的タンパク質ノックダウン (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] MCMBPはMCM2-7ヘテロ六量体形成を促進することにより、 ヒト細胞の安定的な染色体DNA複製に寄与する (2021)
  • 著者名/発表者名: 鐘巻将人
  • 学会等名: 第39回染色体ワークショップ・第19回核ダイナミクス研究会
• [図書] 実験医学12月号 クローズアップ実験法 (2021)
  • 著者名/発表者名: 斎藤裕一朗、鐘巻将人
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 9784758125505
• [産業財産権] オーキシンデグロンシステムのキット、及びその使用 (2021)
  • 発明者名: 鐘巻将人、林謙一郎、根岸剛文
  • 権利者名: 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2021-135637
  • 出願年月日: 2021