| 研究領域 | 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05436
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
田中 伊知朗 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 教授 (20354889)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2021年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2020年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
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| キーワード | リゾチーム / 加水分解酵素 / 反応機構再解明 / 中性子解析 / 予想外のプロトネーション / 加水分解反応 / リゾチーム酵素 / 高速分子動画 / 反応遅延 / X線高分解能構造解析 / 糖環のゆがみ / 共有結合 / X線自由電子レーザー / 中性子 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
光をトリガとせず、反応を遅延させる抗凍結剤等を併用したpHジャンプによってリゾチームの加水分解反応を追跡する。基本はXFELで追跡した電子密度を解析して解釈するが、一部を凍結して中性子解析することにより、そのスナップショットにおける水素や水の通り道が同定できる可能性がある。このため、反応機構の分子レベルでの情報量が増加し、加水分解機構そのものの全容解明に迫ることが期待できる。
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| 研究実績の概要 |
リゾチームは細菌の細胞壁ペプチドグリカンを構成する多糖成分の N-アセチルムラミン酸 （NAM）とN-アセチルグルコサミン（NAG）の間のグリコシド結合を加水分解する酵素である。半世紀前からリゾチームの糖鎖切断機構は提案されているが、いまだに様々な反応機構が議論されている。現在、最も強く提唱されている反応機構は、リゾチームの中間体が共有結合を形成して反応が進行するというものであるが、これはリゾチームと共有結合を作りやすいフッ素系リガンドで行った不自然かつ共有結合を形成するのが当然な条件下での結果によるものである。生化学的な実験結果でも最近、共有結合性は低いとされている。
我々はまず、加水分解後の生成物（NAG)4と酵素の複合体にて、高分解能 X線解析を行い、その結果、Asp52の側鎖がしっかりとした水素結合を形成しているため回転しにくいほか、Dサイトの糖鎖のC1とAsp52側鎖の距離が長すぎて、共有結合するのは難しいとわかった。そこでさらに、水素も含めた相互作用を考察するために、pD4.5の（NAG)4リゾチーム複合体にて常温で中性子回折実験を行った。
現在、X/N同時精密化で、R-work/free:0.1427/0.1644（X）、同0.1743/0.2485（N）まで解析を進めた。その結果、Asp52側鎖の予想外のプロトネーションを確認することができた。このプロトネーションは同様に行った(NAG）3リゾチーム複合体の中性子解析でも観察された。一方で、リゾチーム単体での中性子解析では、確認できていない。このプロトネーションは、（NAG）5複合体のX線解析に関しても、構造安定性から、我々も含めて複数のグループが示唆している。このように、リゾチームの反応中間体が共有結合を経るのが困難なことを、予想外のプロトネーションという中性子解析の結果からも改めて示すことができた。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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