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(6-4)光回復酵素によるDNA修復過程の分子動画撮影

公募研究

研究領域高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
研究課題/領域番号 20H05442
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関大阪大学

研究代表者

山元 淳平  大阪大学, 基礎工学研究科, 准教授 (90571084)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2022-03-31
研究課題ステータス 完了 (2021年度)
配分額 *注記
6,890千円 (直接経費: 5,300千円、間接経費: 1,590千円)
2021年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2020年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
キーワードDNA修復 / DNA損傷 / 光回復酵素 / 反応解析 / 構造生物学 / 光回復
研究開始時の研究の概要

本研究提案では、変異原性の高いDNA損傷である(6-4)光産物を修復することができる(6-4)光回復酵素のDNA修復機構を明らかにするため、 (6-4)光回復酵素-DNA共結晶を用いた時分割シリアルフェムト秒結晶構造解析(TR-SFX)ならびそれを補完する分光測定を行う。申請者が提唱している(6-4)光回復酵素の逐次的2光子修復反応機構における中間体構造を明らかにすることで、発見から20余年が経過した(6-4)光回復酵素のDNA修復反応機構の世界的議論に決着をつける。

研究実績の概要

DNA修復酵素の一つである(6-4)光回復酵素による修復反応を時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析によって追跡することを目的とし、クラミドモナス由来動物類縁型クリプトクロム(CraCRY)と損傷DNA複合体の共結晶作成およびSACLAでの構造解析を行なった。DNA配列に工夫を施すことで、酵素-DNA複合体の微結晶を再現性良く作成することに成功した。酸化型FADを有するCraCRY-DNA複合体の三次元構造を2.2オングストロームの分解能で解いたところ、従来の低温シンクロトロン構造とは異なり、DNA修復活性に重要なヒスチジン側鎖の配向が常温では揺らいでいることが明らかとなった。DNA修復活性を示す二電子還元型FADH-を有するCraCRY-DNA複合体共結晶を得るため、暗下嫌気条件下にて共結晶化を行なったところ、DNA修復活性を有する共結晶の作成にも成功した。今後、SACLAにて時分割測定を行う。
また、溶液中におけるDNA修復反応の追跡のため、修復反応に伴い過渡的に形成する中性FADHラジカルの寿命を測定したところ、1光子目の反応は40マイクロ秒で、また2光子目の反応は200ナノ秒で進行することを見出し、学術誌に投稿・受理された。これは時分割実験において重要な入力パラメーターであるため、この知見をもとにして今後SACLAでの実験を進める。さらに、赤外分光法による構造解析を行うため、反応に関与すると考えられる損傷内のヒドロキシ基酸素原子を重原子へと置換したDNA基質を合成し、兵庫県立大・久保教授のグループと共同研究を行った。現在、反応中間体と考えられる信号が得られており、今後重原子置換基質を用いて中間体の構造同定を進める。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2021 実績報告書
  • 2020 実績報告書
  • 研究成果

    (11件)

すべて 2022 2021 2020 その他

すべて 国際共同研究 (5件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 3件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (1件)

  • [国際共同研究] 台湾・Academia Sinica(その他の国・地域)

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [国際共同研究] CEA Saclay(フランス)

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [国際共同研究] フィリップ大学マールブルグ(ドイツ)

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [国際共同研究] フィリップ大学マールブルグ(ドイツ)

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [国際共同研究] 台湾・中央研究院(その他の国・地域)

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [雑誌論文] Kinetics of Electron Returns in Successive Two-Photon DNA Repair by (6-4) Photolyase2022

    • 著者名/発表者名
      Klaus Brettel, Pavel Mueller, Junpei Yamamoto
    • 雑誌名

      ACS Catalysis

      巻: 12 号: 5 ページ: 3041-3045

    • DOI

      10.1021/acscatal.2c00492

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Limited solvation of an electron donating tryptophan stabilizes a photoinduced charge-separated state in plant (6-4) photolyase2022

    • 著者名/発表者名
      Yuhei Hosokawa, Pavel Mueller, Hirotaka Kitoh-Nishioka, Shigenori Iwai, Junpei Yamamoto
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 12 号: 1 ページ: 5084-5084

    • DOI

      10.1038/s41598-022-08928-0

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Serial crystallography captures dynamic control of sequential electron and proton transfer events in a flavoenzyme2022

    • 著者名/発表者名
      Maestre-Reyna M, Yang CH, Nango E, Huang WC, Putu EPGN, Wu WJ, Wang PH, Franz-Badur S, Saft M, Emmerich HJ, WHY, LCC, HKF, CYK, LJH, WJH, GW, CCW, PAH, SM, OS, HY, JY, YA, TR, TT, LF, TK, HKC, KS, Schapiro I, Spadaccini R, Royant A, Yamamoto J, Iwata S, Essen LO*, Bessho Y*, Tsai MD*
    • 雑誌名

      Nature Chemistry

      巻: - 号: 6 ページ: 677-685

    • DOI

      10.1038/s41557-022-00922-3

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Key interactions with deazariboflavin cofactor for light-driven energy transfer in Xenopus (6-4) photolyase2021

    • 著者名/発表者名
      Ayaka Morimoto, Yuhei Hosokawa, Hiromu Miyamoto, Rajiv Kumar Verma, Shigenori Iwai, Ryuma Sato, Junpei Yamamoto
    • 雑誌名

      Photochemical & Photobiological Sciences

      巻: 20 号: 7 ページ: 875-887

    • DOI

      10.1007/s43630-021-00065-3

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Enhanced DNA repair by DNA photolyase bearing an artificial light-harvesting chromophore2020

    • 著者名/発表者名
      Yuma Terai, Ryuma Sato, Risa Matsumura, Shigenori Iwai, Junpei Yamamoto
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Research

      巻: 48 号: 18 ページ: 10076-10086

    • DOI

      10.1093/nar/gkaa719

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Light-induced movements of amino acid residues in Chlamydomonas reinhardtii animal-like cryptochrome and their roles in photoreduction.2021

    • 著者名/発表者名
      中村麻愛、細川雄平、岩井成憲、山元淳平
    • 学会等名
      第59回生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書

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公開日: 2020-04-28   更新日: 2022-12-28  

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