| 研究領域 | 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05448
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 大阪医科薬科大学 |
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研究代表者 |
村川 武志 大阪医科薬科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
6,890千円 (直接経費: 5,300千円、間接経費: 1,590千円)
2021年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2020年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
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| キーワード | シリアルフェムト秒結晶構造解析 / トパキノン / アミン酸化酵素 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
酵素が化学反応を効果的かつ特異的に進めるには，触媒各段階での活性部位環境の最適化が必須であり，これにより活性化エネルギーの低減，反応特異性などが可能となる．タンパク質のダイナミクスに基づくこれらの視点は，触媒反応を明らかにするうえで，今後さらに重要性を増すと考えられるが，現時点では，高速で切り替わる各触媒過程を精密に観測することは難しく，抜本的な新規測定法の確立が必要となる．本研究では土壌細菌由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，微結晶溶液と基質溶液の二液混合による時分割SFX測定を行う．得られたデータに計算化学などの解析結果を加え，酵素触媒の極めて速い反応過程を可視化する．
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| 研究実績の概要 |
本研究では土壌細菌由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，微結晶溶液と基質溶液の二液混合時分割シリアルフェムト秒結晶構造解析(SFX)を行い，反応時間軸に沿った様々な構造情報を得る．得られた知見により，これまで未解明であった，触媒過程の各段階における活性部位環境の最適化，およびそれに基づく反応促進機構の詳細を明らかにすることを目指す．
本年度は，前年度確立した測定条件に沿って，嫌気条件下における二液混合時分割SFXを実施した．試料であるAGAOは，大腸菌を宿主として発現し精製し，微結晶は，ミクロシーディング法とバッチ法を組み合わせることにより得た．リキットジェット法による微結晶液と基質溶液の二液混合SFX測定はSACLA BL2にて実施した．
SFX測定について，本年度は，基質との混合後0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4秒の5セットのデータを取得した．得られたデータについてCrystfelを用いて指数付けおよび積分を行った．各測定条件とも50000 - 70000枚程度のイメージファイルに対しindexを付けることに成功した．上記の積分したデータを用いて，これまでに放射光を用いて決定した構造（3WA2）を用いて分子置換及び精密化を行い，補酵素TPQ及び，生成物であるフェニルアセトアルデヒドについてオミットマップを描き，反応中間体の同定を行ったところ，反応時間軸に沿った様々な構造変化を確認することができた．
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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