高速分子動画でみる金属酵素活性中心におけるNO還元反応

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 20H05451
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (00548993)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円); 2021年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円); 2020年度: 3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
• キーワード: 金属酵素 / 一酸化窒素 / X線自由電子レーザー / 時間分解計測 / 反応中間体 / ヘム / 嫌気条件 / X線結晶構造解析 / 時間分解構造解析 / ケージド化合物 / X線構造解析 / 時間分解構造奇跡

研究開始時の研究の概要

タンパク質の約30%をしめる金属酵素は、生体内において様々な生理反応に関与しており、高難度な物質変換を高効率・高選択的に行うことができる。しかし、我々は、金属酵素に秘められた高活性・高効率な機能の仕組みを理解できていない。これは、金属酵素が機能する様子を直接観測する手法が確立していないために、その反応機構の詳細な理解に至っていないことに起因する。そこで、本申請課題では、金属酵素が機能する様子を直接的に観るための時間分解X線結晶構造解析の基盤技術を確立する。

研究実績の概要

ヘム鉄および非ヘム鉄からなる膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）の複核活性中心で行われる一酸化窒素（NO）還元の反応機構の解明のために、X線自由電子レーザーを利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応途中の構造を明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解計測が可能であることを示してきており、本課題では、NORの結晶試料にケージドNOを浸潤させた試料を用い、時間分解構造解析を行うことを計画している。NORによるNO還元反応は、還元型NORにNOが結合することで進行するため、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐことが重要となる。つまり、NORの反応を時間分解構造解析により追跡するためには、嫌気条件下での時間分解X線構造解析を行う必要がある。そこで、本課題では、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを考えた。
昨年度の実験からエチレン・ビニルアルコール共重合体からなる酸素バリア性フィルムを用いることでNORの還元状態を保持することができることを見出したので、引き続き同フィルムを用いて実験を行った。酸素バリア性フィルムを用い、サンドイッチ法により脂質キュービック相（LCP）法で結晶化を行い、酸化型NORの結晶を得た。得られた結晶をフィルム事くり抜き専用のホルダに貼り付けることで、フィルムを開封することなくX線回折実験を行った。フィルムによる強い散乱が生じるものの、結晶化条件の最適化の結果、2.4 Åの分解能で構造解析を行うことができた。また、ケージドNO存在下でも良質な結晶を得ることがきており、今後の時間分解計測にむけての準備が整ったと言える。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] リバプール大学/Diamond Light Source/エセックス大学(英国)
• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Essex/Diamond Light Source(英国)
• [雑誌論文] Mechanism of substrate inhibition in cytochrome-c dependent NO reductases from denitrifying bacteria (cNORs) (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Hirotoshi、Faponle Abayomi S.、Hagedoorn Peter-Leon、Tosha Takehiko、de Visser Sam P.、Moenne-Loccoz Pierre
  • 雑誌名: Journal of Inorganic Biochemistry 巻: 231 ページ: 111781-111781
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2022.111781
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: - 号: 26 ページ: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 号: 21
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 号: 1 ページ: 467-467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An unprecedented insight into the catalytic mechanism of copper nitrite reductase from atomic-resolution and damage-free structures (2021)
  • 著者名/発表者名: Rose Samuel L.、Antonyuk Svetlana V.、Sasaki Daisuke、Yamashita Keitaro、Hirata Kunio、Ueno Go、Ago Hideo、Eady Robert R.、Tosha Takehiko、Yamamoto Masaki、Hasnain S. Samar
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 7 号: 1
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd8523
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impact of membrane protein-lipid interactions on formation of bilayer lipid membranes on SAM-modified gold electrode (2021)
  • 著者名/発表者名: Kato Masaru、Masuda Yuya、Yoshida Narumi、Tosha Takehiko、Shiro Yoshitsugu、Yagi Ichizo
  • 雑誌名: Electrochimica Acta 巻: 373 ページ: 137888-137888
  • DOI: 10.1016/j.electacta.2021.137888
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] NO Dynamics in Microbial Denitrification System (2021)
  • 著者名/発表者名: Tosha Takehiko、Yamagiwa Raika、Sawai Hitomi、Shiro Yoshitsugu
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 50 号: 2 ページ: 280-288
  • DOI: 10.1246/cl.200629
  • NAID: 130007986360
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hanae Takeda, Tatsunari Kimura, Takashi Nomura, Masaki Horitani, Azusa Yokota, Akiko Matsubayashi, Shoko Ishii, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo and Takehiko Tosha
  • 雑誌名: Bulletin of the Chemical Society of Japan 巻: - 号: 7 ページ: 825-833
  • DOI: 10.1246/bcsj.20200038
  • NAID: 130007879554
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Serial Femtosecond Zero Dose Crystallography Captures a Water‐Free Distal Heme Site in a Dye‐Decolorising Peroxidase to Reveal a Catalytic Role for an Arginine in Fe IV =O Formation (2020)
  • 著者名/発表者名: Lucic Marina、Svistunenko Dimitri A.、Wilson Michael T.、Chaplin Amanda K.、Davy Bradley、Ebrahim Ali、Axford Danny、Tosha Takehiko、Sugimoto Hiroshi、Owada Shigeki、Dworkowski Florian S. N.、Tews Ivo、Owen Robin L.、Hough Michael A.、Worrall Jonathan A. R.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 59 号: 48 ページ: 21656-21662
  • DOI: 10.1002/anie.202008622
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Time-resolved techniques provide mechanism for nitric oxide reduction by nitric oxide reductase (2021)
  • 著者名/発表者名: Tosha T., Takeda H., Shiro Y., Kubo M.
  • 学会等名: Pacifichem 2021
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
  • 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した時間分解構造解析による酵素反応の可視化 (2020)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 日本薬学会第141回年会
  • 招待講演
• [学会発表] マイクロ秒時間領域で形成される一酸化窒素還元酵素反応中間体の分光解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第58回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 構造生物学におけるXFELと放射光の相補的利用～金属酵素の反応機構解明を目指して～ (2020)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 放射光ユーザーのためのSACLAの利活用に関するワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] 時間分解結晶構造解析および分光解析が明らかにする金属酵素による一酸化窒素分解機構 (2020)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第2回量子線科学セミナー
  • 招待講演
• [図書] 第4章、第2節 生体鉄の分子科学と細胞生物学、“生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御” (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣、澤井仁美、當舎武彦
  • 総ページ数: 13
  • 出版者: NTS出版