モータータンパク質の揺らぎと性能の相関を調べる超高速光学顕微鏡の開発

• 研究領域: 揺らぎが機能を決める生命分子の科学
• 研究課題/領域番号: 21107517
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 飯野 亮太 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (70403003)
• 研究期間 (年度): 2009 – 2010
• 研究課題ステータス: 完了 (2010年度)
• 配分額: 7,280千円 (直接経費: 5,600千円、間接経費: 1,680千円); 2010年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円); 2009年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
• キーワード: 分子モーター / 1分子計測 / 1分子イメージング / ATP合成酵素 / 暗視野顕微鏡 / 金コロイド / 光学顕微鏡 / ゆらぎ

研究概要

1分子蛍光イメージングに用いられる対物型エバネッセント照明光学系をもとに新しいレーザー暗視野光学系を開発し、回転分子モーターF_1-ATPaseの高時間・高空間分解能計測に適用した。
構築した計測システムの光学系は、従来の全反射型蛍光顕微鏡(エバネッセント顕微鏡)に用いられるものとほぼ同じである。新システムでは、ダイクロイックミラーの代わりに中心部が光を透過するミラーを配置しているだけである。試料を照明するレーザー光はミラーで反射され検出器(Hi-speed camera)には入らないが、試料由来の散乱光はミラーの中心部を通って検出器に投射され暗視野像が得られる。照明光を励起光としても利用すれば,暗視野像と蛍光像を同時に取得することも可能である。さらに通常の暗視野顕微鏡と異なりコンデンサーレンズを必要としないので試料上部にスペースを確保でき、マイクロマニピュレーターや細胞培養装置等との併用もできる。直径40nmの金コロイドをプローブとした際には、時間分解能9.1μs(使用した検出器の限界値)で1.5nm程度の位置決定精度が達成でき、従来の暗視野顕微鏡を用いた以前の報告例(320μsで5～6nmの精度)を大幅に改善できた。さらにこの計測システムをF_1モーターの回転計測に適用した結果、回転停止中のプローブの揺らぎからF_1の涙じり弾性(剛性)が求められた。また回転中のF_1の角速度は一定にならないことが明らかとなり、この結果からF_1のトルクには角度依存性があることが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ueno H, Nishikawa S, Iino R, Tabata KV, Sakakihara S, Yanagida T, Noji H.
  • 雑誌名: Biophys.J. 巻: 98 ページ: 2014-2023
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluctuation theorem applied to F_1-ATPase. (2010)
  • 著者名/発表者名: Hayashi K, Ueno H, Iino R, Noji H.
  • 雑誌名: Phys Rev.Lett 巻: 104
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphate-release in F_1-ATPase catalytic cycle follows ADP release. (2010)
  • 著者名/発表者名: Watanabe R, Iino R, Noji H.
  • 雑誌名: Nat Chem.Biol 巻: 6 ページ: 814-820
  • 査読あり
• [雑誌論文] Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators (2009)
  • 著者名/発表者名: Imamura, H., Huynh Nhat, K.P., Togawa, H., Saito, K., Iino, R., Kato-Yamada, Y., Nagai, T., Noji, H.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA. 106 ページ: 15651-15656
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single-molecule study on the temperature-sensitive reaction of F_1-ATPase with a hybrid F_1 carrying a single ss (E 190D) (2009)
  • 著者名/発表者名: Enoki, S., Watanabe, R., Iino, R., Noji, H.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 284 ページ: 23169-23176
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanism of inhibition by C-terminal α-helices of the ε subunit of Escherichia coli F_0F_1-ATP synthase (2009)
  • 著者名/発表者名: Iino, R., Hasegawa, R., Tabata, K.V., Noji, H.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 284 ページ: 17457-17464
  • 査読あり
• [雑誌論文] Preparation and Biological Application of Water-In-Oil Microchamber Array Formed on Hydrophobic/Hydrophilic Patterned Surface. (2009)
  • 著者名/発表者名: Iino R, Sakakihara S, Noji H
  • 雑誌名: Proc μTAS 2 ページ: 1121-1123
  • 査読あり
• [学会発表] 分子モーターの性質を調べる1分子計測技術 (2011)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: (社)日本電気計測器工業会 関西支部 第29回戦略的基盤技術検討委員会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2011-02-07
• [学会発表] ATP合成酵素を1分子技術で視る・操る (2010)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 光塾第2回研究会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2010-12-11
• [学会発表] Single-molecule studies on the fluctuation and function of a rotary motor protein ATP synthase (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryota Iino
  • 学会等名: The 4th International Symposium "Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions"
  • 発表場所: 大津
  • 年月日: 2010-11-30
• [学会発表] 1分子技術で生体回転ナノモーターを視る・操る (2010)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 特定領域研究「高次系分子科学」若手の会研究会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2010-11-26
• [学会発表] 中身を出し入れできる細胞サイズのうつわを創る (2010)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 細胞を創る研究会3.0シンポジウム「器をつくる」
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2010-11-12
• [学会発表] Fluctuation and function of a rotary motor protein (2010)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会シンポジウム「Fluctuation and Function of Biomolecules」
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2010-09-20
• [学会発表] Single-Molecule Imaging of Ion-Transporting Rotary Motor Protein (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryota Iino, Khek-Chian Tham, Kazuhito V.Tabata, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: International Symposium of Joint Research Network on Advanced Materials and Devices
  • 発表場所: Sapporo (Japan)
  • 年月日: 2010-03-25
• [学会発表] 超微小反応容器を用いた1分子バイオアッセイ (2010)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太, 野地博行
  • 学会等名: 第57回応用物理学関連連合講演会シンポジウム「ナノバイオエンジニアリングの現状と未来像」
  • 発表場所: 神奈川県平塚市
  • 年月日: 2010-03-18
• [学会発表] Fluctuation theorem applied to F_1-ATPase (2010)
  • 著者名/発表者名: Kumiko Hayashi, Hiroshi Ueno, Ryota Iino, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: Biophysical Society 54^<th> Annual Meeting
  • 発表場所: San Francisco (USA)
  • 年月日: 2010-02-24
• [学会発表] The role of P_i-release as the main torque generating step of F_1-ATPase (2010)
  • 著者名/発表者名: Rikiya Watanabe, Hiroshi Ueno, Ryota Iino, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: Biophysical Society 54^<th> Annual Meeting
  • 発表場所: San Francisco (USA)
  • 年月日: 2010-02-21
• [学会発表] Simple Total Internal Reflection Dirk-field Microscopy with Nanometer spatial precision and Microsecond Temporal Resolution (2009)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno, So Nishikawa, Ryota Iino, Kazuhito Tabata, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: The 3^<rd> International Symposium : Molecular Science of Fluctuation toward Biological Functions
  • 発表場所: Nagoya (Japan)
  • 年月日: 2009-12-20
• [学会発表] Direct observation of steps in c-ring rotation of Escherichia coli F_0F_1-ATP synthase (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryota Iino
  • 学会等名: JST/CREST Symposium : WBMA'09 (Watching Biomolecules in Action)
  • 発表場所: Osaka (Japan)
  • 年月日: 2009-12-15
• [学会発表] Simple Total Internal Reflection Dirk-field Microscopy with Nanometer spatial precision and Microsecond Temporal Resolution (2009)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno, So Nishikawa, Ryota Iino, Kazuhito Tabata, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第47回(2009年度)日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島県
  • 年月日: 2009-11-01
• [学会発表] Stiffness of Y subunit of F_1-ATPase (2009)
  • 著者名/発表者名: Daichi Okuno, Ryota Iino, Rie Hasegawa, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第47回(2009年度)日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島県
  • 年月日: 2009-11-01
• [学会発表] Mechanism of inhibition by C-terminal α-helices of the ε subunit of Escherichia coil F_0F_1-ATP synthase (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryota Iino, Rie Hasegawa, Kazuhito Tabata, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第47回(2009年度)日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島県
  • 年月日: 2009-11-01
• [学会発表] The completion of chemo-mechanical coupling scheme of F_1-ATPase ; The determination of the timing of P_i-release (2009)
  • 著者名/発表者名: Rikiya Watanabe, Hiroshi Ueno, Ryota Iino, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第47回(2009年度)日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島県
  • 年月日: 2009-11-01
• [学会発表] Torque measurements of F_1-ATPase by using the fluctuation theorem (2009)
  • 著者名/発表者名: Kumiko Hayashi, Hiroshi Ueno, Ryota Iino, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第47回(2009年度)日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島県
  • 年月日: 2009-10-30
• [学会発表] 36-degree stepping rotation of F_0F_1-ATP synthase (2009)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Noji, Ryota Iino
  • 学会等名: International Symposium "Innovative Nanoscience of Supermolecular Motor Proteins Working in Biomembranes"
  • 発表場所: Kyoto (Japan)
  • 年月日: 2009-09-09
• [図書] Fundamental Properties and Structuredited of F_1-ATPase "In Encyclopedia of Biophysics" edited by Roberts G.C. (2011)
  • 著者名/発表者名: Okuno D, Iino R, Noji H.
  • 出版者: Springer(India)(In press)
• [図書] ATP synthase-Structure and dynamics of the smallest rotary motor proteins. In "Molecular Biology of Assemblies and Machines" edited by Baumeister W, Johnson L, Perham R, and Steven A. (2011)
  • 著者名/発表者名: Noji H, Iino R.
  • 出版者: Garland(England)(In press)
• [図書] 「第4章 第1節 第1項 生体膜超分子モーター-細胞の回転エネルギー変換装置:ATP合成酵素」超分子サイエンス&テクノロジー (2009)
  • 著者名/発表者名: 飯野亮太、田端和仁、野地博行
  • 出版者: NTS