高圧力NMR法による蛋白質の準安定状態にもとづいた構造・機能相関

• 研究領域: 揺らぎが機能を決める生命分子の科学
• 研究課題/領域番号: 21107525
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 理工系
• 研究機関: 立命館大学
• 研究代表者: 北原 亮 立命館大学, 薬学部, 講師 (70512284)
• 研究期間 (年度): 2009 – 2010
• 研究課題ステータス: 完了 (2010年度)
• 配分額: 7,020千円 (直接経費: 5,400千円、間接経費: 1,620千円); 2010年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円); 2009年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
• キーワード: NMR / 高圧力 / 蛋白質 / 高エネルギー構造 / 水和 / 圧力 / 構造揺らぎ / ユビキチン / 人工設計

研究概要

代表者らの高圧力NMR研究によりユビキチンの準安定構造N2の構造解析が3000気圧下でなされている。N2構造は常圧下では10%程度の存在確率であり、その精密な構造解析や機能解明を目的としてN2構造を模倣するモデル変異体の合理的設計を行った。1気圧下のN1構造と3000気圧下のN2構造を比較して減弱している相互作用を特定した。またユビキチン様蛋白質の配列及び構造アラインメント解析を行い、保存性の高い部位や相互作用を特定した。それらに基づいてQ41Aなど4種類の変異体を作成した。1H/15N化学シフト解析から、変異に伴い一部で顕著な変化が見られた。変異によるシフト変化と圧力によるそれに明確な相関が得られたことから、変異により高圧下と同様にN2構造の分布率が増加したと考えられる。Q41AではN2分布率52%まで増加した。15N-スピン緩和測定(R1,R2,NOE)を行い主鎖の運動性を解析した。ピコ秒～ナノ秒の速い運動についてはWTと同レベルであった。横緩和測定(R2値)をWTのそれと比較すると、αヘリックス領域を中心に明確な増加が観測されたことから、N1-N2間の構造揺らぎがR2の化学交換項に寄与していることが示唆された。Cleanex-PM-NMR測定(水和アミドプロトンの特定)により、αヘリックス領域で明確な水和信号が観測されたことから、N2構造の分布率増加が裏付けられた。また野生型と変異体で相互作用ペプチドUIMやE1-E2-E3カスケード反応による機能性の評価を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Structural plasticity of staphylococcal nuclease probed by perturbation with pressure and pH (2011)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno, Kazuyuki Akasaka, Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Martin, A.Schroer, Christoph Jeworrek, Metin Tolan, Roland Winter, Julien Roche, Christian Roumest, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer
  • 雑誌名: Proteins 巻: 79 ページ: 1293-1305
  • 査読あり
• [雑誌論文] Solution structure of LC5, the CCR5-derived peptide for HIV-1 inhibition (2010)
  • 著者名/発表者名: K.Miyamoto. Kayo Togiya, Ryo Kitahara et al.
  • 雑誌名: J.Peptide Science 16 ページ: 165-170
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pressure-dependent structure changes in Barnase on ligand binding reveal intermediate rate functions (2009)
  • 著者名/発表者名: D.J.Wilton, Ryo Kitahara, et al.
  • 雑誌名: Biophysical Journal 97 ページ: 1482-1490
  • 査読あり
• [学会発表] 高圧力NMRで見る蛋白質の高エネルギー構造の世界 (2011)
  • 著者名/発表者名: 北原亮
  • 学会等名: よこはまNMR構造生物学研究会第41回ワークショップ
  • 発表場所: 理化学研究所横浜研究所(神奈川県)
  • 年月日: 2011-03-02
• [学会発表] The Functional Importance of Locally Disordered Structures of Proteins (2011)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara
  • 学会等名: Intrinsically disordered regions in proteins and related topics
  • 発表場所: 立命館大学(滋賀県)
  • 年月日: 2011-01-31
• [学会発表] High pressure NMR reveals a locally disordered conformation of insulin (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Akiko Tanji, Souichirou Kitazawa, Yoshihiro Taniguchi
  • 学会等名: Pacifichem2010
  • 発表場所: ハワイ・アメリカ
  • 年月日: 2010-12-19
• [学会発表] High-Energy State Mutant of Ubiquitin (2010)
  • 著者名/発表者名: Soichiro Kitazawa, Maho Yagi, Kenji Sugase, Koichi Kato, Ryo Kitahara
  • 学会等名: The 4th International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • 発表場所: 近江ピアザ(滋賀県)
  • 年月日: 2010-11-30
• [学会発表] NMR Characterization of High-Energy state of ubiquitin and poly-ubiquitin (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara
  • 学会等名: The 4th International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • 発表場所: 近江ピアザ(滋賀県)
  • 年月日: 2010-11-30
• [学会発表] 準安定状態が安定化されたユビキチン変異体 (2010)
  • 著者名/発表者名: 北沢創一郎、矢木真穂、菅瀬謙治、加藤晃一、北原亮
  • 学会等名: 第49回NMR討論会
  • 発表場所: タワーホール船堀(東京都)
  • 年月日: 2010-11-15
• [学会発表] 高圧力NMR法によるLys48結合型ジユビキチンの構造揺らぎ (2010)
  • 著者名/発表者名: 北原亮、平野貴志、矢木真穂、秦和澄、赤坂一之、加藤晃一
  • 学会等名: 第49回NMR討論会
  • 発表場所: タワーホール船堀(東京都)
  • 年月日: 2010-11-15
• [学会発表] 準安定構造が安定化したユビキチン変異体のNMR解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 北沢創一郎, 矢木真穂, 菅瀬謙治, 加藤晃一, 北原亮
  • 学会等名: 第60回日本薬学会近畿支部総会・大会
  • 発表場所: 摂南大学(大阪府)
  • 年月日: 2010-10-30
• [学会発表] Conformational fluctuation of highly stable form of staphylococcal nuclease delta +pHS and its V66K variant studied by high pressure NMR spectroscopy (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Julien Roche, Christian Roumestand, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 東北大学(宮城県)
  • 年月日: 2010-09-21
• [学会発表] Dynamics of Lys48-linked di-ubiquitin as studied by NMR spectroscopy (2010)
  • 著者名/発表者名: Takashi Hirano, Olivier Serve, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Ryo Kitahara, Koichi Kato
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 東北大学(宮城県)
  • 年月日: 2010-09-21
• [学会発表] High pressure NMR reveals significant shifts in populations of higher-energy conformers in ubiquitin variants (2010)
  • 著者名/発表者名: Souichirou Kitazawa, Maho Yagi, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka4, Ryo Kitahara
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 東北大学(宮城県)
  • 年月日: 2010-09-21
• [学会発表] The Functional Importance of Locally Disordered Structures of Proteins (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 東北大学(宮城県)
  • 年月日: 2010-09-21
• [学会発表] Conformational fluctuation of Lys48-linked diubiquitin characterized by high-pressure NMR spectroscopy (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Kazumi Hata, Yoshihiro Taniguchi, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • 学会等名: 第48回日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 東北大学(宮城県)
  • 年月日: 2010-09-20
• [学会発表] High pressure NMR reveals evolutinally conserved intermediates between ubiquitin and NEDD8 (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara
  • 学会等名: 13th international symposium at MNRC
  • 発表場所: 滋賀医科大学(滋賀県)
  • 年月日: 2010-09-01
• [学会発表] High-pressure NMR characterizes conformational fluctuation of Lys48-linked diubiquitin (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Kazumi Hata, Yoshihiro Taniguchi, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • 学会等名: 24th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: ケアンズ オーストラリア
  • 年月日: 2010-08-23
• [学会発表] Conformational fluctuation of highly stable form of staphylococcal nuclease ・+PHS and its V66K variant studied by high pressure NMR spectroscopy (2010)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Julien Roche, Christian Roumestand, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: 24th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • 発表場所: ケアンズ オーストラリア
  • 年月日: 2010-08-23
• [学会発表] 高圧力NMR法によるユビキチンの高エネルギー構造に基づく構造-機能相関研究 (2010)
  • 著者名/発表者名: 北原亮、北沢創一郎、坂田絵理、平野貴志、矢木内海真穂、谷口吉弘、水島恒裕、赤坂一之、加藤晃一
  • 学会等名: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター(北海道)
  • 年月日: 2010-06-18
• [学会発表] Comparative studies of conformational fluctuation of ubiquitin-like proteins by high pressure NMR (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: The 3rd International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • 発表場所: 名古屋市 名古屋大学豊田講堂
  • 年月日: 2009-12-20
• [学会発表] Dynamics of di-ubiquitin as studied by NMR spectroscopy (2009)
  • 著者名/発表者名: Takashi, Hirano, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Ryo Kitahara, Koichi Kato
  • 学会等名: The 3rd International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • 発表場所: 名古屋市 名古屋大学豊田講堂
  • 年月日: 2009-12-20
• [学会発表] Intermediate conformer of the Lyme disease vaccine candidate OspA probed with variable pressure NMR spectroscopy (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Alana Simorellis Shigeyuki Yokoyama, Shohei Koide, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: NMR討論会
  • 発表場所: 博多市 九州大学馬出キャンパス医学部百年講堂
  • 年月日: 2009-11-11
• [学会発表] Conformational fluctuation of di-ubiquitin studied by variable pressure NMR (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Kazumi Hata, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • 学会等名: 日本生物物理学会年会
  • 発表場所: 徳島市 アスティ徳島
  • 年月日: 2009-10-31
• [学会発表] Comparative studies of ubiquitin-like proteins by high pressure NMR reveal the crusial role of high-energy conformers in physiology (2009)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka
  • 学会等名: 日本生化学会年会
  • 発表場所: 神戸市 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2009-10-21
• [図書] 広がるNMRの世界-40人の研究者からの熱いメッセージ- (2011)
  • 著者名/発表者名: 朝倉哲郎編著, 北原亮, ら
  • 総ページ数: 182
  • 出版者: コロナ社
• [備考]
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/pharmacy/kitahara/kitahara_lab.html