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進化分子工学によるユビキチン化酵素基質の同定と選択的タンパク質分解法の開発

公募研究

研究領域ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア
研究課題/領域番号 21H00273
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関東京大学

研究代表者

寺井 琢也  東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (00508145)

研究期間 (年度) 2021-04-01 – 2023-03-31
研究課題ステータス 完了 (2022年度)
配分額 *注記
7,280千円 (直接経費: 5,600千円、間接経費: 1,680千円)
2022年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2021年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
キーワードユビキチン / 進化分子工学 / タンパク質分解 / cDNA display / 人工抗体
研究開始時の研究の概要

本研究では、ポリペプチドの進化分子工学を用いてユビキチン・プロテアソームシステムの更なる理解と制御を目指す。具体的には、DNAと連結したペプチドの大規模ライブラリーを用いた試験管内淘汰実験により、ユビキチン化酵素基質ペプチドの網羅的同定を行い、新たな科学的知見を得ると共にタンパク質分解誘導への応用を目指す。また、内在性標的タンパク質に結合する単一ドメイン抗体の探索と分子改変によって、刺激依存的な新規タンパク質分解誘導法の開発を目指す。

研究実績の概要

「①特定のE3に選択的に認識・分解されるペプチド配列の同定」については前年度の研究の過程で、E3によるin vitroユビキチン化反応が再現性に欠ける結果であったため、種々検討を行ったところ、反応に用いる一部の酵素が失活しやすくそれまでの保存条件に問題があったことが判明した。保存方法を変更した後は概ね安定して結果が得られるようになったため、p53ペプチドの一部をランダム化したdisplay分子ライブラリーを調製し、MDM2によるユビキチン化と抗体によるプルダウンからなるセレクションを数回繰り返した。しかし定量PCRによる評価の結果、セクション前後で一定の回収率の上昇が見られたものの、十分な増大には至らなかった。その原因として、ランダム化していない固定領域内に複数のリジン残基があり、それらが一部ユビキチン化されてしまう事が考えられた。そこでライブラリーの設計を見直して現在セクションをやり直している。ここで十分な回収率の上昇が達成されれば、配列解析によってMDM2の基質認識に関する新たな知見が得られると期待される。
また「② 標的タンパク質に結合する新規VHHの探索と、刺激依存的な分解誘導」については、VHHに類似したVNARライブラリーを用いて、プロテアソーム関連タンパク質に対する結合分子の取得を目指した。しかしcDNA display分子は形成されるものの、なぜかタグペプチドを用いた精製に難航し、最終的なライブラリーの多様性が期待より低く留まっている。今後はこの点を改善した上で、セレクションへと進めたい。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2022 実績報告書
  • 2021 実績報告書
  • 研究成果

    (33件)

すべて 2023 2022 2021 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 2件、 査読あり 2件) 学会発表 (29件) (うち国際学会 9件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Chemigenetic indicators based on synthetic chelators and green fluorescent protein2022

    • 著者名/発表者名
      Zhu Wenchao、Takeuchi Shiori、Imai Shosei、Terada Tohru、Ueda Takumi、Nasu Yusuke、Terai Takuya、Campbell Robert E.
    • 雑誌名

      Nature Chemical Biology

      巻: 19 号: 1 ページ: 38-44

    • DOI

      10.1038/s41589-022-01134-z

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Barcodes, co-cultures, and deep learning take genetically encoded biosensor multiplexing to the nth degree2022

    • 著者名/発表者名
      Terai Takuya、Campbell Robert E.
    • 雑誌名

      Molecular Cell

      巻: 82 号: 2 ページ: 239-240

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2021.12.017

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 国際共著
  • [雑誌論文] Interleukin-17A Peptide Aptamers with an Unexpected Binding Moiety Selected by cDNA Display under Heterogenous Conditions2021

    • 著者名/発表者名
      Anzai Hiroki、Terai Takuya、Wakabayashi-Nakao Kanako、Noguchi Taro、Kumachi Shigefumi、Tsuchiya Masayuki、Nemoto Naoto
    • 雑誌名

      ACS Medicinal Chemistry Letters

      巻: 12 号: 9 ページ: 1427-1434

    • DOI

      10.1021/acsmedchemlett.1c00217

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] A chemigenetic red fluorescent calcium ion indicator based on a fluorescent protein and a synthetic chelator2023

    • 著者名/発表者名
      Shosei Imai, Wenchao Zhu, Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] cDNAディスプレイ法によるE3ユビキチンリガーゼ認識配列の探索手法開発2023

    • 著者名/発表者名
      玉川建和, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本薬学会第143年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] 細胞内ナトリウムイオンイメージングを目指した蛍光タンパク質有機分子 融合型センサーの改良2023

    • 著者名/発表者名
      竹内志織, 朱文超, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本薬学会第143年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] Towards a high-performance genetically-coded fluorescent biosensor for pyruvate2023

    • 著者名/発表者名
      Carl Anthony Suerte, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本化学会第103春季年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] Chemi-genetic sensors for metal ions using green fluorescent protein2022

    • 著者名/発表者名
      Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      Photonics North 2022
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] A chemi-genetic ion indicator archetype consisting of a synthetic metal chelator and a fluorescent protein2022

    • 著者名/発表者名
      Wenchao Zhu, Wenchao Zhu, Takuya Terai, Yusuke Nasu, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第16回年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] cDNA display法を用いたE3ユビキチンリガーゼ 基質配列の探索手法開発2022

    • 著者名/発表者名
      玉川建和, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第16回年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] 細胞内イメージングを目指したケミジェネティックNa+センサーの開発と評価2022

    • 著者名/発表者名
      竹内志織, 朱文超, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第16回年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] Towards the development of novel single fluorescent protein-based biosensors for sugar phosphates2022

    • 著者名/発表者名
      Karl Matthew Lin, Fu Chai, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert Earl Campbell
    • 学会等名
      第22回日本蛋白質科学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] ピペラジン誘導体とHaloTag-緑光蛍光タンパク質(GFP)を用いた 二酸化炭素検出センサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      柳町拓海, Kelvin K. Tsao, 朱文超, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      生体機能関連化学部会 第33回サマースクール
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] GFP と合成キレーターを組み合わせた ケミジェネティックカルシウムセンサーの親和性向上2022

    • 著者名/発表者名
      今井渉世, Wenchao Zhu, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      生体機能関連化学部会 第33回サマースクール
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] Progress towards a third generation near-infrared genetically encoded calcium ion indicator with improved brightness2022

    • 著者名/発表者名
      Fu Chai, Karl Lin, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      The 36th Annual Symposium of The Protein Society
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Self-complementing Split Fluorescent Protein-Based Biosensors for Calcium Ion2022

    • 著者名/発表者名
      Issei Yamaguchi, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert E Campbell
    • 学会等名
      The 36th Annual Symposium of The Protein Society
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] A chemi-genetic ion indicator consists of a synthetic chelator and green fluorescent protein2022

    • 著者名/発表者名
      Wenchao Zhu, Wenchao Zhu, Takuya Terai, Yusuke Nasu, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      The 36th Annual Symposium of The Protein Society
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] タンパク質工学を用いた高性能な化学遺伝学的カリウムイオンセンサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      程大洲, 朱文超, 那須雄介, 寺井琢也, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      第31回日本バイオイメージング学会学術集会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
  • [学会発表] 金属イオンを標的とするchemi-genetic蛍光センサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      寺井琢也
    • 学会等名
      第96回日本薬理学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Evolutionary molecular engineering for the discovery of substrate peptides for E3 ligases and the development of an ubiquitin biosensor2022

    • 著者名/発表者名
      Kenwa Tamagawa, Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      The International Symposium in Tokyo 2022 Ubiquitin New Frontier “from Neo-Biology to Targeted Protein Degradation”
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] cDNA display法によるユビキチン化酵素(E3)基質配列のスクリーニング手法の開発研究2022

    • 著者名/発表者名
      劉建和、寺井琢也、CAMPBELL Robert
    • 学会等名
      日本化学会 第102春季年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] ピペラジン誘導体と HaloTag-緑色蛍光タンパク質(GFP)融合タン パク質を用いた二酸化炭素検出蛍光バイオセンサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      柳町拓海、Kelvin Tsao、Wenchao Zhu、寺井琢也、Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本化学会 第102春季年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] Rapid construction of L-lactate biosensor color variants by transposon-mediated insertion2022

    • 著者名/発表者名
      Fu Chai, Karl Matthew Lin, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      日本化学会 第102春季年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] 細胞内ナトリウムイオンのイメージングを目指した蛍光タンパク質有機分子融合型センサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      竹内 志織、Wenchao Zhu、寺井 琢也、Robert Campbell
    • 学会等名
      日本化学会 第102春季年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] 小分子キレーターと蛍光タンパク質を用いた化学遺伝学的Ca2+センサーの開発2022

    • 著者名/発表者名
      朱 文超、寺井 琢也、那須 雄介、Robert Campbell
    • 学会等名
      日本化学会 第102春季年会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] 指向性進化を活用した新規 chemi-geneticカルシウム蛍光センサーの開発2021

    • 著者名/発表者名
      寺井 琢也、朱 文超、程 大洲、那須 雄介、CAMPBELL Robert
    • 学会等名
      第15回 バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] Photoactive Yellow Protein タグを用いたchemi-genetic蛍光カルシウムイオンセンサーの開発2021

    • 著者名/発表者名
      門屋 颯人、那須 雄介, 寺井 琢也, Campbell Robert
    • 学会等名
      第15回 バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] Prototype Screening of HaloTag-based Chemigenetic Indicators2021

    • 著者名/発表者名
      Dazhou Cheng, Wenchao Zhu, Takuya Terai, Yusuke Nasu, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      第15回 バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
  • [学会発表] Development of a new type of chemi-genetic calcium ion indicator2021

    • 著者名/発表者名
      Wenchao Zhu, Takuya Terai, Yusuke Nasu, Robert E. Campbell
    • 学会等名
      Pacifichem 2021
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] In vitro selection of polypeptides using cDNA display technology2021

    • 著者名/発表者名
      Takua Terai, Naoto Nemoto
    • 学会等名
      Pacifichem 2021
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Chemi-genetic fluorescent probes for visualizing local dynamics of metal ions2021

    • 著者名/発表者名
      Takuya Terai, Tomoya Hirata, Ryo Taguchi, Wenchao Zhu, Yasuteru Urano, Robert Earl Campbell
    • 学会等名
      Pacifichem 2021
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Self-complementing split fluorescent protein-based biosensors for calcium ion2021

    • 著者名/発表者名
      Issei Yamaguchi, Yusuke Nasu, Takuya Terai, Robert E Campbell
    • 学会等名
      Pacifichem 2021
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 国際学会
  • [備考] 東京大学大学院理学系研究科化学専攻生体分子化学研究室ホームページ

    • URL

      https://www.chem.s.u-tokyo.ac.jp/campbell/

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書 2021 実績報告書

URL: 

公開日: 2021-04-28   更新日: 2023-12-25  

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