新規on-chipスクリーニング技術による分子機械の機能改変

• 研究領域: 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計
• 研究課題/領域番号: 21H00388
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 講師 (10546592)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円); 2022年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円); 2021年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
• キーワード: 分子機械 / 進化分子工学 / ATPase / 回転分子モーター / マイクロデバイス

研究開始時の研究の概要

本研究ではマイクロチャンバーデバイスを用いたF1-ATPaseのon-chipスクリーニング技術の確立およびマイクロチャンバーデバイス内におけるF1-ATPaseの分子進化（高活性化）の実現を目指す。最終的に得られた進化した（速く回転する）F1-ATPaseを、1分子回転解析および構造解析により詳細に調べる。その結果とこれまでの1分子回転解析や構造解析の知見とを照らし合わせることで、回転分子機械F1-ATPaseの回転速度の違いが何に起因しているのかというF1モーターの作動原理の一端を明らかにする。

研究実績の概要

本研究ではATPの化学エネルギーを力学的な回転運動へと変換する回転分子機械F1-ATPase を新規進化分子工学的手法により分子進化させ、機能改変した分子機械を創成することを目的とする。そこで本研究では、我々がこれまでに確立してきたマイクロチャンバーデバイス内でのon-chipスクリーニング技術の拡張を行った。デバイス内でのスクリーニングを実現するにはF1-ATPaseの反応のデバイス内検出が必須になる。そこでATP分解で生じるADPを酵素カップリング反応によりデバイス内で蛍光検出する新規方法を開発した。その結果、F1-ATPase１分子のATPase活性のデバイス内定量を実現した。デバイス内でのATPaseの1分子活性の定量に成功したのは本研究が初めてである。現在、この系を用いたスクリーニングを検討中である。また別のアプローチとして、F1-ATPaseの1分子回転観察と無細胞タンパク質合成系を組み合わせた新規on chipスクリーニグ技術を開発した。この系は、配列既知のDNAライブラリを用いてF1-ATPaseの無細胞合成を行った後、on-chipに転写し1分子回転観察を行うもので、細胞を全く使わずにDNAライブラリからのF1-ATPaseの合成・1分子回転計測を数時間で実現することができる。この実験系により、リン酸解離に関わるとMDシミュレーションで予測された残基の20種類の変異F1を1度の実験（数時間程度）で1分子回転解析することを実現し、各変異がF1の触媒反応過程や回転機能に与える影響を詳細に解析することに成功している。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] University of New South Wales(オーストラリア)
• [国際共同研究] Stockholm University(スウェーデン)
• [国際共同研究] University of New South Wales(オーストラリア)
• [国際共同研究] Stockholm University(スウェーデン)
• [雑誌論文] Rotary properties of hybrid F1-ATPases consisting of subunits from different species (2023)
  • 著者名/発表者名: Ryo R. Watanabe, Busra Tas Kiper, Mariel Zarco-Zavala, Mayu Hara, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Jose J. Garcia-Trejo, Chun-Biu Li, Hiroyuki Noji
  • 雑誌名: iScience 巻: 26 号: 5 ページ: 106626-106626
  • DOI: 10.1016/j.isci.2023.106626
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Molecular mechanism on forcible ejection of ATPase inhibitory factor 1 from mitochondrial ATP synthase (2023)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Ryohei、Ueno Hiroshi、Okazaki Kei-ichi、Noji Hiroyuki
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-023-37182-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic Perturbation Alters Functional Substates in Alkaline Phosphatase (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakuma Morito、Honda Shingo、Ueno Hiroshi、Tabata Kazuhito V.、Miyazaki Kentaro、Tokuriki Nobuhiko、Noji Hiroyuki
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 145 号: 5 ページ: 2806-2814
  • DOI: 10.1021/jacs.2c06693
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Direct identification of the rotary angle of ATP cleavage in F1-ATPase from Bacillus PS3 (2023)
  • 著者名/発表者名: Hasimoto Yuh、Sugawa Mitsuhiro、Nishiguchi Yoshihiro、Aeba Fumihiro、Tagawa Ayari、Suga Kenta、Tanaka Nobukiyo、Ueno Hiroshi、Yamashita Hiroki、Yokota Ryuichi、Masaike Tomoko、Nishizaka Takayuki
  • 雑誌名: Biophysical Journal 巻: 122 号: 3 ページ: 554-564
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2022.12.027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural Elements Involved in ATP Hydrolysis Inhibition and ATP Synthesis of Tuberculosis and Nontuberculous Mycobacterial F-ATP Synthase Decipher New Targets for Inhibitors (2022)
  • 著者名/発表者名: Wong Chui Fann、Saw Wuan-Geok、Basak Sandip、Sano Mio、Ueno Hiroshi、Kerk Hwee Wen、Litty Dennis、Ragunathan Priya、Dick Thomas、M?ller Volker、Noji Hiroyuki、Gr?ber Gerhard
  • 雑誌名: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 巻: 66 号: 12
  • DOI: 10.1128/aac.01056-22
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Direct observation of stepping rotation of V-ATPase reveals rigid component in coupling between Vo and V1 motors (2022)
  • 著者名/発表者名: Otomo Akihiro、Iida Tatsuya、Okuni Yasuko、Ueno Hiroshi、Murata Takeshi、Iino Ryota
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 号: 42
  • DOI: 10.1073/pnas.2210204119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enzyme-based digital bioassay technology ? key strategies and future perspectives (2022)
  • 著者名/発表者名: Noji Hiroyuki、Minagawa Yoshihiro、Ueno Hiroshi
  • 雑誌名: Lab on a Chip 巻: 22 号: 17 ページ: 3092-3109
  • DOI: 10.1039/d2lc00223j
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] How Does F1-ATPase Generate Torque?: Analysis From Cryo-Electron Microscopy and Rotational Catalysis of Thermophilic F1 (2022)
  • 著者名/発表者名: Noji Hiroyuki、Ueno Hiroshi
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 13 ページ: 904084-904084
  • DOI: 10.3389/fmicb.2022.904084
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Amplification of Over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets (2021)
  • 著者名/発表者名: Ueno,H., Sawada,H., Soga,N., Sano,M., Nara,S., Tabata,K.V., Su’etsugu, M., Noji,H.
  • 雑誌名: ACS Synthetic Biology 巻: 10 号: 9 ページ: 2179-2186
  • DOI: 10.1021/acssynbio.0c00584
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The six steps of the complete F1-ATPase rotary catalytic cycle (2021)
  • 著者名/発表者名: Sobti Meghna、Ueno Hiroshi、Noji Hiroyuki、Stewart Alastair G.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 号: 1 ページ: 4690-4690
  • DOI: 10.1038/s41467-021-25029-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Elucidation and control of low and high active populations of alkaline phosphatase molecules for quantitative digital bioassay (2021)
  • 著者名/発表者名: Ueno Hiroshi、Kato Makoto、Minagawa Yoshihiro、Hirose Yushi、Noji Hiroyuki
  • 雑誌名: Protein Science 巻: 30 号: 8 ページ: 1628-1639
  • DOI: 10.1002/pro.4102
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Engineering approaches to understanding the unidirectional regulatory function of F1-ATPase (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno
  • 学会等名: 2022 East Asian Single-Molecule Biophysics Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] エンジニアリング的アプローチによる回転分子モーターF1-ATPaseの設計原理の理解 (2022)
  • 著者名/発表者名: 上野博史
  • 学会等名: 第11回分子モーター討論会
  • 招待講演
• [学会発表] 全反射型暗視野顕微鏡による生体分子モーターの1分子イメージング (2022)
  • 著者名/発表者名: 上野博史
  • 学会等名: ニコンWebセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Engineering approaches to understanding the design principles of F1-ATPase (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno
  • 学会等名: Sendai2022 Workshop
  • 招待講演
• [学会発表] ) Unidirectional regulation of ATPase factor 1 in mitochondrial ATP synthase studied by single-molecule manipulation experiments (2022)
  • 著者名/発表者名: Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Kei-ichi Okazaki, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Torque Generation Mechanism of F1 -ATPase (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Noji, Hiroshi Ueno
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Resurrection of the Ancestral ATPase (2022)
  • 著者名/発表者名: Aya Suzuki, Ryutaro Furukawa, Hiroshi Ueno, Satoshi Akanuma, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Rotation dynamics and structure of F1-ATPase with all α-subunit-type P-loops (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno, Meghna Sobti, Rie Koga, Tomoko Masaike, Alastair Stewart, Nobuyasu Koga, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Development of new DNA recovery technology from fL droplet array using optical tweezers (2022)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Ohashi, Hiroshi Ueno, Yoshihiro Minagawa, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] In vitro screening of F1 -ATPase based on single molecule rotation assay coupled to cell-free protein synthesis (2022)
  • 著者名/発表者名: Mai Taguchi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] ATP driven rotation of mutant FoF1 where H+ translocation is rate-limiting (2022)
  • 著者名/発表者名: Kiyoto Yasuda, Daichi Ando, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Fluorometric digital ATPase assay with single-enzyme detection sensitivity (2021)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Ueno, Mio Sano, Mayu Hara, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] In vitro synthesis of F1 -ATPase and construction of single molecule rotation assay system for cell-free screening (2021)
  • 著者名/発表者名: Mai Taguchi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Correlation between the fluctuation of single enzyme activity and evolvability (2021)
  • 著者名/発表者名: Takahito Iida, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Elucidation of molecular recognition mechanism of IF1 , a regulator of F1 -ATPase, studied by an engineering approach (2021)
  • 著者名/発表者名: Yuichiro Hatasaki, Ryo Watanabe, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Dissociation mechanism of IF1 from mitochondrial ATP synthase revealed by singlemolecule analysis and manipulation (2021)
  • 著者名/発表者名: Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Functional analysis of ATPase complex in Type Three Secretion System of Enteropathogenic Escherichia coli (2021)
  • 著者名/発表者名: Aya Suzuki, Yuki Tajimi, Ryo Kurosaki, Hiroshi Ueno, Takayuki Uchihashi, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第59回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 1分子回転観察と操作によって解明されたミトコンドリア由来ATP合成酵素における阻害因子IF1の制御機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小林 稜平、上野 博史、野地 博行
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] Functional analysis of ATPase complex in Type Three Secretion System of Enteropathogenic Escherichia coli (2021)
  • 著者名/発表者名: Aya Suzuki, Yuki Tajimi, Ryo Kurosaki, Hiroshi Ueno, Takayuki Uchihashi, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] Rotary properties of hybrid F1-ATPases consisting of subunits from different species (2021)
  • 著者名/発表者名: Ryo Watanabe, Mariel Zarco-Zavala, Busra Tas, Mayu Hara, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Jose J. Garcia-Trejo, Chun-Biu Li, Hiroyuki Noji
  • 学会等名: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] ミトコンドリアATP合成酵素における制御因子IF1の一方向反応制御システムを司る分子基盤の探索 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小林 稜平、上野 博史、野地 博行
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第47回討論会
• [学会発表] Cell-freeスクリーニングに向けたF1-ATPaseのin vitro合成及び1分子回転観察系の構築 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田口 真衣、上野 博史、野地 博行
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第47回討論会
• [備考] 回転分子モーターの動きをコントロールする「留め金」はモーターの回転方向に依存して外れる
  • URL: https://www.appchem.t.u-tokyo.ac.jp/news/20230403-1/
• [備考] 酵素の分子個性のダイバーシティは酵素進化のバロメーターとなる
  • URL: https://www.appchem.t.u-tokyo.ac.jp/news/202302210-1/