| 研究領域 | 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計 |
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| 研究課題/領域番号 |
21H00397
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
中村 秀樹 京都大学, 白眉センター, 特定准教授 (50435666)
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| 研究期間 (年度) |
2021-08-23 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
2022年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2021年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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| キーワード | 合成生物学 / 細胞骨格 / マイクロマシン / 細胞内タンパク質結晶 / 光操作 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
研究代表者は先行研究で、細胞内のアクチン重合を時空間的に操作して機械的力を発生する合成生物学ツール、ActuAtorの開発に成功した。本計画では、変形が無視できる硬さで、顕微鏡下で形態を明確に観察できる細胞内タンパク質結晶を発動する機械的力の「受け手」としてActuAtorを作用させる。結晶の形や光刺激の時空間的パターンを精密に制御し、細胞内のタンパク質結晶の運動を自在に操作する技術の開発に取り組む。生きた細胞内のタンパク質結晶を自在に操り、合成生物学ツールActuAtorを文字通り「アクチュエータ」とする“細胞内マイクロマシン”の確立を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本年度の研究では、細胞内で結晶化するタンパク質iBox-PAK4catの結晶化能について前年度に引き続きさらなる検討を行った。まず、前年度に予備的実験に成功していたiBox-PAK4cat細胞内結晶の成長末端への任意タンパク質の刺激依存的集積実験について、iBox-PAK4catに刺激依存的に二量体化するタンパク質ドメイン、FKBP・FRB（小分子化合物刺激用）およびSspB ・iLIDのみを融合させたプラスミドを作成して検討を行った。これらのタンパク質は、蛍光による可視化のためのGFPを融合させたタンパク質とは異なり、それぞれのタンパク質1種類のみの過剰発現で細胞内に棒状の結晶をつくることを明らかにした。これらのツールは細胞内タンパク質結晶のエンジニアリングにおいて簡便かつ有力なツールである。
一方で、棒状結晶の末端のみでなく、側面全体にタンパク質を集積させる技術の開発を目指して二量体化ドメインとiBox-PAK4catとの間のリンカー長を変化させた実験を行った。しかし、リンカー長によらず側面への明確なタンパク質集積は現在のところ確認できていない。
前年度よりセットアップを開始していた倒立蛍光顕微鏡ステージ上でのCO2インキュベーションシステムのセットアップが完了し、iBox-PAK4など細胞内タンパク質結晶の核形成や結晶成長を~24時間程度までの長時間イメージングで観察することに成功した。このシステムはタンパク質結晶の形成メカニズムや、結晶に限らず細胞内で凝縮するタンパク質の凝縮ダイナミクスの研究において有能なイメージング系である。
タンパク質結晶マイクロマシンの駆動装置であるActuAtorについての検討も引き続き行い、ActuAtorを用いて細胞内のストレス顆粒を離散させると細胞全体のmRNA翻訳活性が向上することを示唆するデータが得られた。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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