| 研究領域 | 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計 |
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| 研究課題/領域番号 |
21H00401
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
蓑島 維文 大阪大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20600844)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
2022年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2021年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
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| キーワード | 化学プローブ / 蛍光イメージング / 蛋白質ラベル化 / 1分子イメージング / プロトンポンプ / 蛍光プローブ / タンパク質標識 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、発動分子となるタンパク質複合体の動態・機能を直接観察するためのタンパク質蛍光標識技術の開発とイメージング解析への応用を行う。これまでに開発したタンパク質を可逆、非可逆に標識する手法のタイミング、濃度の制御のしやすさ、高い特異性、機能性の付与といった利点を活かし、回転運動によりプロトンを膜を隔てて輸送するプロトンポンプや歩行するように運動し細胞内の物質輸送を行うモータータンパク質の解析法へ応用する。
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| 研究実績の概要 |
蛍光イメージングは発動分子となるタンパク質複合体の機能・動態を直接観察する手法として強力なツールである。本研究では化学に基づいて機能性蛍光プローブをタグとなるタンパク質を介し共有結合、非共有結合で標識する技術を活用し、発動分子となるタンパク質複合体の動態と機能を計測するためのツールを開発する。
第一に、外部エネルギー源を駆動力として回転運動により膜を隔ててプロトンを輸送するプロトンポンプの動態と機能を生細胞内で可視化解析することを目的とした。pHプローブをタンパク質にラベル化し、局所に固定化して計測する手法を構築できたため、その応用研究を進めた。まずは生細胞におけるラベル化とイメージングを行い、プローブがラベル化できることを確認した。次にpH変化を計測する系として、エネルギーの枯渇した飢餓状態においてタンパク質が低pHオルガネラであるリソソームへ移行する過程の可視化を試みた。標識のためにβラクタマーゼをタグ付けしたGFPを細胞内に発現し、pH応答性プローブでラベル化後、飢餓状態に晒した。その結果、時間経過とともにリソソームにあたる区画からプローブ由来の輝点が観察され、pH変化の可視化を達成した。
第二の目的として、繰り返しタンパク質に標識できる蛍光プローブを用い、1分子イメージングを利用した発動分子動態の長距離トラッキング解析を行った。前年度までに繰り返し標識できる蛍光プローブを用いた1分子イメージングが可能であることが分かっていたため、分子モーターとしてはたらくキネシンへタグを介して標識を行った。ATPを加えることでキネシンが微小管上を動く様子を可視化することができた。また、プローブ濃度を上げて常時入れ替わる状態にすることで、動かない状態ではあるが長時間1分子イメージングができることを実証した。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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