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神経変性疾患に関わる凝集体の形成・抑制の in situ 構造生物学

公募研究

研究領域マルチファセット・プロテインズ:拡大し変容するタンパク質の世界
研究課題/領域番号 21H05733
研究種目

学術変革領域研究(A)

配分区分補助金
審査区分 学術変革領域研究区分(Ⅲ)
研究機関国立研究開発法人理化学研究所

研究代表者

山形 敦史  国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (20463903)

研究期間 (年度) 2021-09-10 – 2023-03-31
研究課題ステータス 完了 (2022年度)
配分額 *注記
10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2022年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2021年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
キーワードクライオ電子顕微鏡 / 凝集体 / アミロイド / アミロイド線維 / 神経変性疾患 / 構造解析
研究開始時の研究の概要

筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病といった重篤な神経変性疾患は、構造異常タンパク質が細胞内で凝集体を形成して引き起こされる。本申請では、これらの凝集体の細胞内の形成・抑制の機構をクライオ電子線トモグラフィー法を用いた in situ 構造解析により解析する。ハンチンチン遺伝子やTDP43の凝集体をモデル凝集体とし、リボソームやシャペロン分子のTRiC/CCT複合体といった分子が細胞内で実際にどのように凝集体と関わりその形成と抑制を制御しているのかを構造を基に明らかにし、神経変性疾患の病態の解明や新たな治療法の開発につなげたい。

研究実績の概要

酵母プリオンの細胞内凝集体の構造解析を目指し、蛍光標識された細胞内凝集体を標的にしたcryo-FIB millingによる薄片化とクライオ電子線トモグラフィーによる解析に挑戦した。出芽酵母の[psi+]株内にGFP標識Sup35NMタンパク質を発現させ細胞内凝集体を形成させたところ、凝集体と思われるドット状の蛍光体を確認した。さらに低濃度の塩酸グアニジンの添加によってロッド状の蛍光体に変化することを確認し、二つの異なる状態の凝集体を形成させた。培養した酵母をそのままグリッドに急速凍結させた後、理化学研究所・横浜事業所のcryo-FIBSEM(Aquilos2)を用いてクライオ条件下での薄片化(ラメラ化)を行なった。得られたラメラを同事業所の加速電圧300kVの透過電子顕微鏡(Titan Krios)を用いて、トモグラフィー測定を行なった。複数のラメラのトモグラフィー測定を行い、解析した結果ミトコンドリアや核膜を確認できた。また細胞内の微小管も確認することができた。しかし、細胞内の凝集体については確認することができなかった。新たにcryo-FIBSEMに蛍光顕微鏡ユニット(iFLM)が設置されたので、今後はラメラ化と蛍光標識を同時に行うことにより、ラメラ内の凝集体を確認した上でのトモグラフィー測定を行う。
次に、培養細胞を用いてアミロイドβ線維やタウ線維のin situ構造解析に挑戦した。Aβ(1-42)、タウのリピートドメイン(3R, 4R)、全長タウ(1N3R)、それぞれのタウに病原性変異(P301L)を導入したものに蛍光タンパク質を融合させた。蛍光タンパク質には mCerulean3, mClover3 のそれぞれを用い、凝集体形成によってFRETが起きるように工夫した。それぞれの遺伝子をpiggyBac系によってゲノムに導入して安定発現株を樹立した。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2022 実績報告書
  • 2021 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2023 2022 2021

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 4件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Cryo-EM structure of a monomeric RC-LH1-PufX supercomplex with high-carotenoid content from Rhodobacter capsulatus2023

    • 著者名/発表者名
      Bracun Laura、Yamagata Atsushi、Christianson Bern M.、Shirouzu Mikako、Liu Lu-Ning
    • 雑誌名

      Structure

      巻: 31 号: 3 ページ: 318-328.e3

    • DOI

      10.1016/j.str.2023.01.006

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Uptake mechanism of iron-phytosiderophore from the soil based on the structure of yellow stripe transporter2022

    • 著者名/発表者名
      Yamagata Atsushi、Murata Yoshiko、Namba Kosuke、Terada Tohru、Fukai Shuya、Shirouzu Mikako
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 13 号: 1 ページ: 7180-7180

    • DOI

      10.1038/s41467-022-34930-1

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Structural basis for activation of DNMT12022

    • 著者名/発表者名
      Kikuchi A, Onoda H, Yamaguchi K, Kori S, Matsuzawa S, Chiba Y, Tanimoto S, Yoshimi S, Sato H, Yamagata A, Shirouzu M, Adachi N, Sharif J, Koseki H, Nishiyama A, Nakanishi M, Defossez PA, Arita K
    • 雑誌名

      Nat Commun.

      巻: 13 (1) 号: 1 ページ: 1-11

    • DOI

      10.1038/s41467-022-34779-4

    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Structural basis for the assembly and quinone transport mechanisms of the dimeric photosynthetic RC-LH1 supercomplex2022

    • 著者名/発表者名
      Cao Peng、Bracun Laura、Yamagata Atsushi、Christianson Bern M.、Negami Tatsuki、Zou Baohua、Terada Tohru、Canniffe Daniel P.、Shirouzu Mikako、Li Mei、Liu Lu-Ning
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 13 号: 1 ページ: 1977-1977

    • DOI

      10.1038/s41467-022-29563-3

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Deadenylase-dependent mRNA decay of GDF15 and FGF21 orchestrates food intake and energy expenditure2022

    • 著者名/発表者名
      Katsumura Sakie、Siddiqui Nadeem、Goldsmith Michael Rock、Cheah Jaime H.、Fujikawa Teppei、Minegishi Genki、Yamagata Atsushi、Yabuki Yukako、Kobayashi Kaoru、Shirouzu Mikako、Inagaki Takeshi、Huang Tim H.-M.、Musi Nicolas、Topisirovic Ivan、Larsson Ola、Morita Masahiro
    • 雑誌名

      Cell Metabolism

      巻: 34 号: 4 ページ: 564-580.e8

    • DOI

      10.1016/j.cmet.2022.03.005

    • 関連する報告書
      2021 実績報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] 理研・横浜事業所における In situ 構造生物への取り組み2022

    • 著者名/発表者名
      山形 敦史
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会分科会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Cryo-EM analyses of the amyloid fibrils causing neurodegenerative diseases2022

    • 著者名/発表者名
      山形 敦史
    • 学会等名
      日本生物物理学会年会
    • 関連する報告書
      2022 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 家族性アルツハイマー病の原因となる変異を持ったアミロイド線維のクライオ電顕による高分解能構造解析2021

    • 著者名/発表者名
      山形敦史、松田勇、石井佳誉、白水美香子
    • 学会等名
      日本分子生物学会
    • 関連する報告書
      2021 実績報告書

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公開日: 2021-10-22   更新日: 2023-12-25  

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