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抗リン酸化ペプチド抗体を用いた細胞周期制御機構の可視化

公募研究

研究領域細胞周期フロンティア-増殖と分化相関
研究課題/領域番号 22019007
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 生物系
研究機関東京大学

研究代表者

上田 宏  東京大学, 大学院・工学系研究科, 准教授 (60232758)

研究分担者 松山 有紀  東京大学, 大学院・工学系研究科, 特任研究員 (30571088)
研究期間 (年度) 2010 – 2011
研究課題ステータス 完了 (2011年度)
配分額 *注記
4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
2011年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
2010年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
キーワード生物・生体工学 / 分析化学 / 蛋白質 / 可視化 / 翻訳後修飾 / 免疫測定 / 細胞信号伝達
研究概要

細胞周期依存的にリン酸化制御を受けることが細胞分裂に必須な、細胞骨格タンパク質ビメンチンSer71,Ser82について、そのリン酸化修飾を蛍光強度でリアルタイムに検出する方法を開発した。
具体的には、無細胞蛋白質合成系を用いてN末端近傍をTAMRAやCR6Gなどのローダミン系蛍光色素でピンポイント標識した一本鎖抗体scFvあるいはFab断片が、抗体内部の芳香族残基による消光(クエンチ)が抗原の結合によって顕著に解消される現象を応用することで、抗原結合によって蛍光強度が増加する抗体プローブQuenchbodyが作れることを見出した。この方法でビメンチンSer71リン酸化認識抗体TM71 scFvをプローブ化したところ、条件最適化の結果、試験管内で対照と比較してリン酸化Ser71ペプチド抗原を加えた場合に最大3倍の蛍光強度上昇が見られた。また、Ser82リン酸化認識抗体MO82 scFvにおいては,分子内に複数のCR6G色素を導入することで色素間クエンチ効果により応答性が向上し,最大6倍の抗原依存的応答を得ることができた。これにより,試験管内でnM程度の高感度でリン酸化を検出することに成功した。
また、還元的な細胞内への導入を念頭に,より大量に細胞内でも安定なFab型抗体プローブを得ることを目指し,モデル抗体のN末端近傍にラベルのためのCys残基を付加した抗原結合活性のあるFab断片を大腸菌で大量発現・精製することに成功した。今後、抗ビメンチンリン酸化抗体についてこれを行い、Cys残基のSH基を介して蛍光ラベルを導入したFabを調製すれば、これらを生細胞への導入することで細胞内でのリン酸化検出が可能になると考えられる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2種類のビメンチンリン酸化を特異的に検出可能な蛍光プローブ作製に成功し,現在論文を投稿中である。プローブの細胞導入についても,安定性の高いFab型として大量に調製できる目処がついた。

今後の研究の推進方策

今後本研究課題を発展させ,標的細胞自身に発現可能な蛍光抗体プローブの一般的な構築法を確立できれば、そのインパクトは大きいと考えられる。

報告書

(2件)
  • 2011 実績報告書
  • 2010 実績報告書
  • 研究成果

    (15件)

すべて 2012 2011 2010 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (5件) 図書 (2件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Detection of small molecule diagnostic markers with phage-based Open-Sandwich Immuno-PCR2012

    • 著者名/発表者名
      J.Dong, S.Hasan, Y.Fujioka, H.Ueda
    • 雑誌名

      J.Immunol.Methods

      巻: 377 号: 1-2 ページ: 1-7

    • DOI

      10.1016/j.jim.2012.01.005

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] "Quenchbodies" : quench-based antibody probes that show antigen-dependent fluorescence2011

    • 著者名/発表者名
      Ryoji Abe, Hiroyuki Ohashi, Issei Iijima, Masaki Ihara, Hiroaki Takagi, Takahiro Hohsaka, Hiroshi Ueda
    • 雑誌名

      J.Am.Chem.Soc.

      巻: 133 号: 43 ページ: 17386-17394

    • DOI

      10.1021/ja205925j

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Activation of circularly permutated β-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules2011

    • 著者名/発表者名
      M.Kojima*, H.Iwai*, J.Dong, S.-L.Lim, S.Ito, K.Okumura, M.Ihara, H.Ueda *equal
    • 雑誌名

      Bioconj.Chem.

      巻: 22 号: 4 ページ: 633-641

    • DOI

      10.1021/bc1004125

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Direct construction of open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of thyroid hormone T42011

    • 著者名/発表者名
      K.N.Islam, M.Ihara, J.Dong, N.Kasagi, T.Mori, H.Ueda
    • 雑誌名

      Anal.Chem.

      巻: 83 ページ: 1008-1014

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Antibody affinity maturation in vitro using unconjugated peptide antigen2010

    • 著者名/発表者名
      H.Iwai, B.Ozturk, M.Ihara, H.Ueda
    • 雑誌名

      Protein Eng.Des.Sel.

      巻: 23 ページ: 185-193

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Expression of antibody variable region-human alkaline phosphatase fusion proteins in mammalian cells2010

    • 著者名/発表者名
      Y.Sasajima, R.Iwasaki, K.Tsumoto, I.Kumagai, M.Ihara, H.Ueda
    • 雑誌名

      J.Immunol.Methods

      巻: 361 ページ: 57-63

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Detection of vimentin serine phosphorylation by Quenchbodies2011

    • 著者名/発表者名
      Hee-Jin Jeong, Hiroyuki Ohashi, Yuki Ohmuro-Matsuyama, Masaki Inagaki, Hiroshi Ueda
    • 学会等名
      AsiaSense 2011 (http://www.asiasense2011.org/)
    • 発表場所
      済州,韓国(Best Poster Award受賞)
    • 年月日
      2011-10-26
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] 非天然アミノ酸導入法による蛍光免疫センサー蛋白質Quenchbodyの創製2011

    • 著者名/発表者名
      上田宏
    • 学会等名
      第11回蛋白質科学会年会1WC-2
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(招待講演)
    • 年月日
      2011-06-07
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] オープンサンドイッチ原理と新規相互作用検出系による蛋白質リン酸化修飾の検出2011

    • 著者名/発表者名
      大室(松山)有紀, 北岡優一, ジョン ヒジン, 達吉郎, 稲垣昌樹, 上田宏
    • 学会等名
      第11回蛋白質科学会年会2WB-3
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(招待講演)
    • 年月日
      2011-06-07
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] Quenchbodies : Antibody Probes That Fluoresce Upon Antigen Binding2011

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Ueda, Ryoji Abe, Hiroaki Takagi, Takahiro Hohsaka
    • 学会等名
      ACB (Asian Congress of Biotechnology) 2011
    • 発表場所
      上海,中国(Selected as oral presentation)
    • 年月日
      2011-05-12
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] 蛍光標識抗体断片の消光解消を原理とする新しい免疫化学測定法2010

    • 著者名/発表者名
      上田宏
    • 学会等名
      生物化学的測定研究会第15回学術シンポジウム
    • 発表場所
      長岡京市中央生涯学習センター
    • 年月日
      2010-11-02
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [図書] "Detection of protein phosphorylation by open-sandwich immunoassay" in Integrative Proteomics (H.-C.Leung) ISBN : 978-953-51-0070-62012

    • 著者名/発表者名
      Y.Ohmuro-Matsuyama, M.Inagaki, H.Ueda
    • 総ページ数
      18
    • 出版者
      InTech, Rijeka, Croatia
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [図書] 抗リン酸化抗体を用いた生細胞での蛋白質リン酸化検出(佐方功幸,稲垣昌樹,岸本健雄編「細胞周期フロンティア」p.11-17)2010

    • 著者名/発表者名
      大室(松山)有紀, 北岡優一, 上田宏
    • 総ページ数
      7
    • 出版者
      共立出版
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/hueda/

    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/hueda/

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書

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公開日: 2010-08-23   更新日: 2018-03-28  

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