RORγt、SMAD2/3転写共役因子複合体精製と機能解析

• 研究領域: 免疫系自己-形成・識別とその異常
• 研究課題/領域番号: 22021039
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 高田 伊知郎 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (50361655)
• 研究期間 (年度): 2010 – 2011
• 研究課題ステータス: 完了 (2011年度)
• 配分額: 9,600千円 (直接経費: 9,600千円); 2011年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円); 2010年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
• キーワード: 転写共役因子 / プロテオミクス / T細胞 / 核内受容体 / Smad

研究概要

申請者はT細胞分化過程(Treg細胞、Th17細胞)においてSmad2/3と相互作用する因子をプロテオミクス手法にて同定し、T細胞分化におけるTGFβ/Smadシグナル系の新たな分化制御の分子機構の解明を行った。また同様にTh17細胞分化に必須である転写因子RORγtの相互作用因子に関しても検討した。まず用いる培養細胞と抽出法を検討した結果、T細胞由来の培養細胞68-41細胞がTGFβ刺激によってSmad2/3の活性化が観察される事、抗CD3抗体刺激も加える事でRORγtの発現誘導が可能な事、核タンパクの分離が精製に適する事を見出した。また精製法を検討した結果、市販のSmad2/3、RORγ抗体が適していた。以上の結果を踏まえ、細胞の大量培養とSmad2/3、RORγtの精製を行った。
質量分析計にてタンパク質を同定した結果、Smad2/3相互作用因子は13種、RORγt相互作用因子は20種類の候補因子を取得した。更に68-41細胞への候補因子強制発現にてI117aまたはFoxp3 mRNA発現変動を検討し、Smad2/3に関しては7種類、RORγtに関しては12種の候補因子が機能する事を見出した。更にこれら候補因子に関しルシフェラーゼレポーターを行いSmadやRORγtの転写活性化機能に関し作用する可能性を検討したところ、特にRORγtに相互作用する機能未知因子の一つがSmad2/3機能の抑制、RORγt機能の促進に作用する事を見出した。またレトロウイルスによる強制発現、RNAiによる発現抑制でも類似した作用を見出した。以上の結果から、今回T細胞分化に機能する新たな転写共役因子の同定に成功した。期間内に発表は出来なかったが、現在投稿準備中である。これらの研究成果によって、自己免疫疾患等における新たな創薬標的を見出した可能性が高いと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Smad2 and Smad3 are redundantly essential for the suppression of iNOS synthesis in macrophages by regulating IRF3 and STAT1 pathways (2012)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama Y, Kakoi K, Kimura A, Takada I, Kashiwagi I, Wakabayashi Y, Morita R, Nomura M, Yoshimura A
  • 雑誌名: Int Immunol 巻: 24 ページ: 253-265
  • 査読あり
• [雑誌論文] Wnt5a-Ror2 signaling between osteoblasts and osteoclast precursors enhances osteoclastogenesis (2012)
  • 著者名/発表者名: Maeda, K., Kobayashi, Y., Udagawa, N., Uehara, S., Ishihara, A., Mizoguchi, T., Kikuchi, Y., Takada, I., Kato, S., Kani, S., Nishita, M., Marumo, K., Martin, T.J., Minami, Y., Takahashi, N.
  • 雑誌名: Nat.Med. 巻: (印刷中) 号: 3 ページ: 405-12
  • DOI: 10.1038/nm.2653
  • 査読あり
• [雑誌論文] Histone 3 lysine 9 (H3K9) methyltransferase recruitment to the interleu kin-2 (IL-2) promoter is a mechanism of suppression of IL-2 transcription by the transforming growth factor-β-Smad pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Wakabayashi Y, Tamiya T, Takada I, Fukaya T, Sugiyama Y, Inoue N, Kimura A, Morita R, Kashiwagi I, Takimoto T, Nomura M, Yoshimura A
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286 ページ: 35456-35465
  • 査読あり
• [学会発表] 肥満におけるPPARγ活性制御シグナルWnt5aの機能解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 高田伊知郎
  • 学会等名: 第32回日本肥満学会
  • 発表場所: 兵庫淡路国際会議場
  • 年月日: 2011-09-23
• [学会発表] Purification and identification of RORγt co-regulators in T helper cells (102) (2010)
  • 著者名/発表者名: Ichiro Takada
  • 学会等名: CSHL meeting, "Nuclear receptors and Disease"
  • 発表場所: Cold spring harbor laboratory, USA
  • 年月日: 2010-09-02