リソソームミクロオートファジーによるエンドソーム分解機構

• 研究領域: マルチモードオートファジー：多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解
• 研究課題/領域番号: 22H04631
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 向井 康治朗 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (90767633)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 9,490千円 (直接経費: 7,300千円、間接経費: 2,190千円); 2023年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
• キーワード: ミクロオートファジー / リソソーム

研究開始時の研究の概要

ミクロオートファジーはリソソーム膜が直接細胞質成分を取り込む機構を指す。酵母においてはペルオキシソーム、脂肪滴、核などがミクロオートファジーを介して分解されることが報告されているが、哺乳動物におけるミクロオートファジーの知見は限られている。本研究では、ミクロオートファジー機構においてリソソームが細胞内の膜構造を認識して分解する分子機構、及びその生物学的意義を明らかにすることを目指す。

研究実績の概要

ミクロオートファジーはリソソーム膜が直接細胞質成分を取り込む機構を指す。酵母においてはペルオキシソーム、脂肪滴、核などがミクロオートファジーを介して分解されることが報告されているが、哺乳動物におけるミクロオートファジーの知見は限られている。
これまでに、我々は細胞内物質輸送による自然免疫応答分子STINGの活性制御機構を明らかにしてきたが、その解析の中で、STINGがミクロオー トファジーによって分解されることを示唆する予備結果を得た。興味深いことに、この過程はリサイクリングエンドソーム由来の小胞の集まり をリソソームが直接貪食する機構であった。本研究ではSTINGをミクロオートファジーのモデル基質として利用し、遺伝学的スクリーニング、 超解像ライブセルイメージング、プロテオミクス解析を駆使することで、リソソームが細胞内の膜構造を認識して分解する分子機構、及びその 生物学的意義を明らかにすることを目指す。
今年度はGFP-STINGの刺激依存的な分解を指標にしたsiRNAスクリーニングにより、ミクロオートファジーに必要な遺伝子を同定した。 超解像ライブイメージング、及び電子顕微鏡解析を用いて、STINGがリソソームによって包み込まれる瞬間、及び分解される過程の可視化を試みた。その結果、超解像顕微鏡解析によりリソソームとSTINGの動態を生細胞内で可視化し、STING陽性の膜構造がリソソーム に包み込まれる瞬間を捉えた。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

今年度はGFP-STINGの刺激依存的な分解を指標にしたsiRNAスクリーニングにより、ミクロオートファジーに必要な遺伝子としてESCRT複合体遺伝子、Tsg101およびVps4を同定した。Tsg101およびVps4を発現抑制した細胞では、刺激後ゴルジ体を通過した後のSTINGがリソソームに取り込まれず、細胞質中に蓄積していることを見出した。さらに、Tsg101の発現抑制およびレスキュー実験から、Tsg101のユビキチン認識ドメインがSTINGのミクロオートファジー分解に必要であることを見出した。また、興味深いことに、STING陽性の膜構造がリソソームに取り込まれる際に、リサイクリングエンドソームタンパク質であるトランスフェリン受容体やRab11の一部がリソソームに取り込まれていることを見出した。この結果から、リソソームによるミクロオートファジーはオルガネラ膜構造を分解する能力を有すると考えられた (Kuchitsu et al., Nat Cell Bilo 2023)。以上の結果は哺乳動物におけるミクロオートファジーに関して新しい知見をもたらすものでることから、当初の計画以上に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

現在STINGのミクロオートファジー分解の分子機構として、STINGのユビキチン化がミクロオートファジーに必要である可能性を見出している。そこで次年度以降は、ユビキチン化修飾に着目してミクロオートファジーの分子機構を明らかにする。具体的には、STINGのユビキチン鎖の結合様式の同定、およびおE3リガーゼの同定を目指す。E3リガーゼに関しては、ハイスループットスクリーニングを行うためにSTINGの分解量を指標にしたマルチウェルプレートベースのアッセイ系の構築を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] STING signalling is terminated through ESCRT-dependent microautophagy of vesicles originating from recycling endosomes. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kuchitsu Y, Mukai K, Uematsu R, Takaada Y, Shinojima A, Shindo R, Shoji T, Hamano S, Ogawa E, Sato R, Miyake K, Kato A, Kawaguchi Y, Nishitani-Isa M, Izawa K, Nishikomori R, Yasumi T, Suzuki T, Dohmae N, Uemura T, Barber GN, Arai H, Waguri S, Taguchi T.
  • 雑誌名: Nature Cell Biology 巻: 25 号: 3 ページ: 453-466
  • DOI: 10.1038/s41556-023-01098-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] STINGの恒常活性化に起因する自己炎症・神経変性疾患 (2022)
  • 著者名/発表者名: 朽津 芳彦、向井 康治朗、田口 友彦
  • 雑誌名: 日本免疫不全・自己炎症学会雑誌 巻: 1 号: 1 ページ: 24-34
  • DOI: 10.34563/jsiadjournal.1.1_24
  • NAID: 130008142173
  • ISSN: 2435-7693
  • 年月日: 2022-01-17
• [学会発表] Lysosomal vesiculophagy terminates STING signalling (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiko Kuchitsu, Kojiro Mukai, Yuki Takaada, Ayumi Shinojima, Shiori Hamano, Rei Uematsu, Emari Ogawa, Takehiro Suzuki, Naoshi Dohmae, Takefumi Uemura, Hiroyuki Arai, Satoshi Waguri, Tomohiko Taguchi
  • 学会等名: The 10th International Symposium on Autophagy (ISA2022)
  • 国際学会
• [学会発表] 発光タンパク質NanoLucを利用したSTING分解のハイスループットスクリーニング (2022)
  • 著者名/発表者名: 東海林 紬, 朽津 芳彦, 篠島 あゆみ, 向井 康治朗, 田口 友彦
  • 学会等名: 第74回日本細胞生物学会大会
• [学会発表] リソソームミクロオートファジーによる STINGの分解を介した自然免疫応答制御 (2022)
  • 著者名/発表者名: 向井 康治朗, 朽津 芳彦, 田口 友彦
  • 学会等名: 第95回日本生化学会大会