| 研究領域 | マルチモードオートファジー：多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H04655
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
西田 友哉 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10581449)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | インスリン / オートファジー / ミクロオートファジー / 超解像顕微鏡 / 膵β細胞 / インスリン分泌顆粒 / クリノファジー / 蛍光レポーター / ゲノムワイドスクリーニング / CRISPR/Cas9 / 糖尿病 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
膵β細胞内でのインスリン分泌顆粒（ Insulin Secretory Granules； ISG）分解の分子機構については未解明であった。我々はそのモニターを可能とする蛍光レポーターを開発した。さらに、CRISPR/Cas9システムと組み合わせ、ゲノムワイドスクリーニングの基礎を確立した。本研究ではISG分解を制御する因子を同定し、個々の因子の機能及び相互作用解析を経て、分解機構の全体像を解明する。さらに、生体内でもISG 分解の評価が可能なモニターマウスを作成してISG分解の評価を行い、同定した制御因子のノックアウトマウスの解析を併せて実施し、ISG分解の持つ病態生理学的意義を解明する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、インスリン分泌顆粒（ Insulin Secretory Granules； ISG）の膵β細胞内分解機構を解明しその病態生理学的意義を明らかにすることを目指した。
はじめに、アミノ酸・グルコース飢餓刺激によって誘導されるISG分解を評価する蛍光レポーターを作製した。CRISPR/Cas9システムによりオートファジー関連遺伝子のノックアウト細胞を作製し、主要なマクロオートファジー制御機構がISG分解に関与しないことを示した。さらに、ゲノムワイドgRNAを用いた遺伝子スクリーニングを実施し、同定された遺伝子群にはマクロオートファジーの制御経路が含まれないことが明らかとなった。
これらの結果を論文として発表する一方（Kanai A. et al. BBRC, 2023)、さらに解析を進めるべく2つの検討を行った。ひとつは、超解像顕微鏡を用いたISG分解のリアルタイム観察であり、ZEISS社製のライトシート顕微鏡を用いてISG下流およびリソソームの挙動を長時間観察することに成功した。もうひとつは、飢餓刺激ではない定常状態のISG分解の評価系の作製である。具体的には、インスリン分子に酸性化環境に耐性の蛍光タンパクであるVenusを結合させたInsulin-Venusを、Tet-Onシステムで発現させる膵β細胞株を作製した。この細胞では、Tet-OnからOffにすることで、ISG分解が誘導されてVenusによる蛍光が消失すること、その消失がリソソームプロテアーゼ阻害薬により阻害されることを示した。
今後は、これらのツールを用いて定常的なISG分解の制御機構に関する検討へと研究を展開させることを企図している。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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