| 研究領域 | 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H04746
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
島田 敦広 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (80723874)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,630千円 (直接経費: 5,100千円、間接経費: 1,530千円)
2023年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2022年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
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| キーワード | X線自由電子レーザー / ポンププローブ実験 / 膜タンパク質 / 金属タンパク質 / プロトンポンプ / 生体エネルギー / 電子伝達 / XFEL / X線発光分光 / 時分割構造解析 / 金属膜タンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
酸化的リン酸化の中枢を担うシトクロム酸化酵素（CcO）は、ヘム鉄と銅で構成される酸素還元中心に結合した酸素を還元する反応と共役して、プロトンをポンプする。わずか数ミリ秒で完結する本酵素の反応機構を解明するために、高強度極短パルス幅のX線であるX線自由電子レーザーを利用したポンプ-プローブ実験を実施し、X線回折（XRD）とX線発光分光（XES）の同時測定により、反応過程の中間体の原子座標と金属イオンの電子状態変化を捉える。本研究の目的は、CcOの比較的安定な反応中間体の遷移過程に存在する、酸素還元反応とプロトンポンプ反応を駆動する化学構造変化を分子動画として捉えることである。
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では酸化的リン酸化の中枢を担うシトクロム酸化酵素（CcO）の反応機構を解本研究課題では酸化的リン酸化の中枢を担うシトクロム酸化酵素（CcO）の反応機構を解明することを目的としている。そのために、CcOの反応中間体のX線回折（XRD）とX線発光分光（XES）を同時に測定することで、これら中間体の化学構造（構成原子の空間座標と電子状態）の酵素反応に伴う変化を追跡する必要がある。そこで、高輝度極短パルスという特徴を持つX線自由電子レーザー（XFEL）によるポンププローブ時分割実験を行うという発想に至った。2023年度の研究では、以下の成果が得られた。
1.微結晶を連続でXFEL照射位置へ移送する方法（SFX法）に適したCcO微結晶の調製法の改良に成功した。2022年度にCcOの高品質な微結晶の調製に成功し、分解能が2.5 オングスロトームの回折データを得ることができた。しかしロット間の格子定数がばらついており、データ処理が難しいという問題があった。そこで、CcOの精製と結晶化時の温度管理や試薬のロット管理を厳密に行うことで、微結晶のロット間での結晶格子のばらつきを抑制することに成功した。これによって従来よりも少ないデータ量で電子密度マップの計算を行うことが出来、1データセットあたり短時間でのデータ収集が可能となった。
2.CO結合還元型CcO微結晶を用いたポンププローブ時分割実験の実施。CO飽和還元剤を調製し、暗幕で覆われた低温嫌気作業ボックス内でCcO微結晶と混合することでCO結合還元型CcO微結晶の調製を試みた。調製したCO結合還元型CcO微結晶を用いて、ポンプ光照射100マイクロ秒後にプローブ光（XFEL）が照射されるようにセッティングを行い、ポンプ光照射の有無による構造変化を捉えられるか確認した。その結果、部分的に結合しているCOの解離が確認された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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