二元機能性青色光受容タンパク質の光応答機構

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 22H04751
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 複合領域
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 山元 淳平 大阪大学, 大学院基礎工学研究科, 准教授 (90571084)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 6,630千円 (直接経費: 5,100千円、間接経費: 1,530千円); 2023年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円); 2022年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
• キーワード: 時分割構造解析 / クリプトクロム / 光応答反応 / DNA修復 / シグナル伝達 / 機能分化

研究開始時の研究の概要

生命の誕生から現在に至るまでの長期に渡り生物のゲノム恒常性維持を担ってきた光回復酵素は、『隠された色素』という意味をもつ青色光受容タンパク質であるクリプトクロムと同一のタンパク質ファミリーを形成する。光回復酵素はDNA修復のみに、またクリプトクロムは概日リズム形成・シグナル伝達・地球磁場の検知といった幅広い生体機能に関与する一方で、同一の構造基盤から異なる生体機能が発現する分子機構はいまだ不明瞭である。
本研究課題では、光回復酵素・クリプトクロム二元機能性タンパク質の各々の機能を明らかにし、これらを関連づけることにより、単一の酵素から異なる生体機能が発現する分子機構を明瞭にする。

研究実績の概要

本研究では、DNA修復を担う光回復酵素と概日リズム形成に関与するクリプトクロムの機能を単一の酵素で成し遂げる二元機能性動物類縁型クリプトクロムに注目し、その光応答分子機構を明らかにすることを目的に研究を行なった。クラミドモナス由来クリプトクロム(CraCRY)の二元機能性がどのように調整されているか調べるため、二電子還元型FADH-の熱力学的および速度論的安定性を評価したところ、DNA修復活性を向上させることが知られている集光アンテナ分子の結合の有無に依存してCraCRYにおけるFADH-の安定性が著しく異なることを明らかにした。
CraCRYによるDNA修復能を評価するため、兵庫県立大学・久保稔教授との共同研究を行ったところ、これまで研究されてきた他の生物種由来の光回復酵素とは異なる機構でDNA修復反応が進行する可能性が示唆された。
また、CraCRYのクリプトクロムとしての構造活性相関を調べるため、CraCRYタンパク質微結晶を用いた時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析(TR-SFX)実験を行った。その結果、光受容中心であるFADからタンパク質C末端にかけて逐次的に構造変化する様子が観測された。10ナノ秒から数マイクロ秒にかけてFADのN5位近傍に存在するアスパラギンが回転し、それに伴い過渡的にFAD結合部位の近傍の溶媒露出部位が構造変化した。50ミリ秒程度でこの状態が暗状態へと回帰し、それに伴いFADの酸化還元状態が変化することから、この部位における過渡的な構造変化がFADプロトン化に関与することを明らかにした。さらに、測定開始点である10ナノ秒から200ミリ秒にかけてC末端アルファヘリックスが大きく構造変化することがわかった。本結果は現在論文にまとめているところである。

現在までの達成度 (段落)

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] フィリップ大マールブルグ(ドイツ)
• [国際共同研究] 台湾・台湾大学/台湾・中央研究院(その他の国・地域)
• [国際共同研究] ESRF(フランス)
• [国際共同研究] 台湾・Academia Sinica/台湾・台湾大学(その他の国・地域)
• [国際共同研究] Phillip University Marburg(ドイツ)
• [国際共同研究] ESRF(フランス)
• [雑誌論文] A deazariboflavin chromophore kinetically stabilizes reduced FAD state in a bifunctional cryptochrome (2023)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa Yuhei、Morita Hiroyoshi、Nakamura Mai、Yamamoto Junpei
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 号: 1
  • DOI: 10.1038/s41598-023-43930-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Visualizing the DNA repair process by a photolyase at atomic resolution (2023)
  • 著者名/発表者名: Manuel Maestre-Reyna, Po-Hsun Wang, Eriko Nango, Yuhei Hosokawa, Martin Saft , Antonia Furrer , Cheng-Han Yang , Eka Putra Gusti Ngurah Putu , Wen-Jin Wu, (…), So Iwata ,(…..) and Ming-Daw Tsai
  • 雑誌名: Science (New York, N.Y.) 巻: Vol.382, No.6674 号: 6674
  • DOI: 10.1126/science.add7795
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Serial crystallography captures dynamic control of sequential electron and proton transfer events in a flavoenzyme (2022)
  • 著者名/発表者名: Maestre-Reyna M, Yang CH, Nango E, Huang WC, Putu EPGN, Wu WJ, Wang PH, Franz-Badur S, Saft M, Emmerich HJ, WHY, LCC, HKF, CYK, LJH, WJH, GW, CCW, PAH, SM, OS, HY, JY, YA, TR, TT, LF, TK, HKC, KS, Schapiro I, Spadaccini R, Royant A, Yamamoto J, Iwata S, Essen LO*, Bessho Y*, Tsai MD*
  • 雑誌名: Nature Chemistry 巻: － 号: 6 ページ: 677-685
  • DOI: 10.1038/s41557-022-00922-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 二元機能性動物類縁型クリプトクロムの 光活性化過程の動的構造解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山元淳平
  • 学会等名: 令和5年度新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 時分割X線結晶構造解析で捉えたDNA光回復酵素によるDNA修復過程 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山元淳平, Manuel Maestre-Reyna, 別所義隆, Lars-Oliver Essen, 蔡明道
  • 学会等名: 第23回日本光生物学協会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 時分割シリアルフェムト秒X線結晶構造解析によるDNA光回復酵素の全修復過程の原子分解能観測 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山元淳平, Manuel Maestre-Reyna, 別所義隆, Lars-Oliver Essen, Ming-Daw Tsai
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第66回年次大会
  • 招待講演
• [学会発表] Time-resolved serial femtosecond crystallography on animal-like cryptochrome from Chlamydomonas reinhardtii (2023)
  • 著者名/発表者名: Yuhei Hosokawa, Mai Nakamura, Junpei Yamamoto, Manuel Maestre-Reyna
  • 学会等名: 第６１回日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] (6-4)光回復酵素による逐次２光子DNA修復反応の時間領域の決定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 山元淳平、Klaus Brettel, Pavel Mueller
  • 学会等名: 第48回生体分子科学討論会
• [学会発表] 植物由来(6-4)光回復酵素内で生成する光誘起電荷分離状態の安定化に局所的水和環境が与える影響の評価 (2022)
  • 著者名/発表者名: 細川雄平、Pavel Mueller、鬼頭（西岡）宏任、岩井成憲、山元淳平
  • 学会等名: 第48回生体分子科学討論会
• [学会発表] Thermodynamic and kinetic factors affecting the redox chemistry of a flavin cofactor in photolyases (2022)
  • 著者名/発表者名: 細川雄平、盛田宏義、中村麻愛、岩井成憲、山元淳平
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会