| 研究領域 | 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H04758
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
下村 拓史 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 助教 (50635464)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
6,630千円 (直接経費: 5,100千円、間接経費: 1,530千円)
2023年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2022年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
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| キーワード | イオンチャネル / 非天然アミノ酸 / 高速分子動画 / 構造生物学 / ケミカルバイオロジー / 電気生理学 / 時分割構造解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、非天然アミノ酸（UAA）を多様な標的タンパク質に導入することで、“狙って”“簡単に”光反応性を付与できるかどうかを検証する。また、得られた光反応性タンパク質を、刺激となる光とX線自由電子レーザーの照射とを精密に組み合わせた結晶構造解析法に適用する。これにより、本来光反応性を有しないタンパク質においても光をトリガーとする高速分子動画撮像が可能になり、その機能を実現するタンパク質の構造変化が原子レベルで解明できると期待される。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、非天然アミノ酸（UAA）を多様な標的タンパク質に導入することで、“狙って”“簡単に”光反応性を付与できるかどうかを検証する。また特にこれらのうち、光異性化非天然アミノ酸（PSAA）を導入することにより、光によりその活性を制御できるイオンチャネルを創出し、得られた光反応性タンパク質を刺激となる光とX線自由電子レーザーの照射とを精密に組み合わせた結晶構造解析法に適用する。前年度には、本来pH感受性のイオンチャネルであるKcsAにPSAAを導入し、卵母細胞を用いた電流測定系を用いてその活性を確認することで、本来非光感受性であるKcsAを光制御できることを確認した。また、大腸菌発現系によりPSAA導入KcsAタンパク質を大量発現・精製し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより結晶構造解析に供することができる品質であることを確認した。
結晶構造解析に向けた確認として、得られた精製KcsAタンパク質が光感受性を有するかどうかを検証した。精製KcsAタンパク質を人工脂質膜に再構成したプロテオリポソームを作製し、微小ガラス電極を用いたパッチクランプ法により電流測定を行った。野生型KcsA精製タンパク質を再構成して電流測定を行ったところ、典型的なpH依存的KcsA電流を測定することができた。これにより、再構成と電流測定の手技は正しく実施できていることが確認できた。同様にPSAA導入KcsAタンパク質を用いてもpH依存性を確認できたが、今のところ光反応性を明確に観測できていない。理由として、特定の種類の脂質分子などといった、人工再構成系では欠落してしまっている因子の存在が考えらえれるため、用いる脂質の検討や、より効率のよい測定系の検討などを行っている。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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