公募研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
地球上の窒素循環において、窒素固定により切断されたN-N結合の再生を触媒し、窒素化合物のバランス維持において重要な膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR)を対象とする。NORはヘム鉄と非ヘム鉄からなる活性中心において、電子伝達およびプロトン化を巧妙に行うことで、化学結合の形成（N-N結合）と開裂（N-O結合）を円滑に行うことができる。そのため、多くの研究者がその反応機構の解明を目指してきたが、未だ反応中間体の構造は解明されておらず、詳細な反応機構の理解に至っていない。そこで、この現状を打破するために、SACLAを利用した時間分解構造解析により、NORの反応中間体の構造を決定することに挑戦する。
膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄および非ヘム鉄からなる複核活性中心において、細胞毒である一酸化窒素（NO）の還元反応を触媒する。NORによるNO還元の化学についての理解を深めるために、本課題では、X線自由電子レーザー（XFEL）を利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応中間体の構造を明らかにすることを目的としている。溶液試料を用いた実験から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解分光計測が可能であることを示してきており、本課題では、これを結晶試料に適用する。NORによるNO還元反応は、還元型NORとNOが反応することで開始されるので、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐ必要がある。つまり、嫌気条件下での時間分解X線構造解析が必要となる。そのために、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを提案し、酸素バリア性フィルムを結晶化プレートとして、NORの結晶を得る方法を確立してきた。本年度は、酸素バリア性フィルムを用いた手法に関して、新たな取り組みとして、海外研究協力者であるDiamond Light Sourceのグループが開発したX線ポンプ・プローブ法の導入を検討した。本手法では、SACLAからのX線をアッテネータにより弱くしたものを励起光源として利用し、はじめに金属活性中心の還元を行う。その後、アッテネータを利用していないXFEL光を利用することで、還元後の酵素の回折データを得るというものでる。本研究期間内には、NORを用いて、本手法を用いた時間分解構造解析を行うまでには、至らなかったが、別の試料での予備結果を得た。今後は、このX線ポンプ・プローブ法とケージドNOを用いた時間分解構造解析を組み合わせることで、NORの反応中間体の構造解析に取り組む。
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
すべて 2024 2023 2022 その他
すべて 国際共同研究 (3件) 雑誌論文 (10件) (うち国際共著 6件、 査読あり 10件、 オープンアクセス 8件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 5件、 招待講演 9件) 備考 (1件)
Proceedings of the National Academy of Sciences
巻: 121 号: 12 ページ: 1-6
10.1073/pnas.2308478121
ACS Catalysis
巻: 13 号: 13 ページ: 8613-8623
10.1021/acscatal.3c01158
Journal of the American Chemical Society
巻: 145 号: 29 ページ: 15796-15808
10.1021/jacs.3c02313
Science Advances
巻: 9 号: 49 ページ: 1-12
10.1126/sciadv.adh4179
The Journal of Physical Chemistry B
巻: 127 号: 4 ページ: 846-854
10.1021/acs.jpcb.2c05852
巻: 119 号: 27
10.1073/pnas.2123385119
巻: 119 号: 30
10.1073/pnas.2205664119
IUCrJ
巻: 9 号: 5 ページ: 610-624
10.1107/s2052252522006418
巻: 12 号: 21 ページ: 13349-13359
10.1021/acscatal.2c03754
Nat Commun.
巻: 13 号: 1 ページ: 7591-7591
10.1038/s41467-022-34771-y
https://www.riken.jp/press/2023/20230111_2/index.html
