| 研究領域 | 神経回路センサスに基づく適応機能の構築と遷移バイオメカニズム |
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| 研究課題/領域番号 |
22H05495
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
濱口 航介 京都大学, 医学研究科, 准教授 (50415270)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
9,880千円 (直接経費: 7,600千円、間接経費: 2,280千円)
2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
2022年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
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| キーワード | 狂犬病ウィルス / バーコード / カルシウムイメージング / 空間トランスクリプトーム / 逆行性ウィルス / ２光子カルシウムイメージング / 透明化 / 局所回路 / FISH / 拡大透明化 / 空間トランスクリプトミクス / バーコード化 / 短期記憶 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
神経細胞は多様なサブタイプを持ち，それぞれが独自の神経回路接続を持つ．RNA-seqや 蛍光 in-situ hybridization (FISH) は細胞の持つ遺伝子発現パターンを調べる事ができる強力な手法であるが，接続情報を取り込む事ができない．本研究で開発する逆行性バーコーディングは，バーコード付き狂犬病ウィルスを用いて細胞同士の接続情報をRNA-seq や FISHに付け加える重要な技術である．本研究では，逆行性バーコーディングと改良されたFISHを用いて，前頭皮質の局所回路構造と関連する遺伝子発現パターンを明らかにする．
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| 研究実績の概要 |
神経細胞には様々な細胞タイプが存在し、複雑な神経回路網を形成している。空間トランスクリプトームの方法は、空間構造を保持したまま、細胞の持つ遺伝子発現パターンを調べる事ができる強力な手法であるが、神経細胞同士の接続情報を調べる事ができない。本研究ではカルシウムイメージング法により活動観察した細胞同士の接続関係を調べるため、バーコード付き狂犬病ウィルスを用い、接続情報を空間トランスクリプトームに付け加える技術、”逆行性バーコーディング”の開発を行った。
ウィルスに付与したバーコードを読むには、いくつかの方法が存在する。従来の空間トランスクリプトーム法では、ごく薄い(10μｍ以下)の脳切片に対してRNAシークエンサーの技術を使うことで未知の塩基配列を読む事が可能である。しかし本研究で用いる神経活動を観察した数百μｍの厚みのある脳切片蛍光には適応が難しい。蛍光 in situ hybridization (FISH) による方法よりは検出感度が高く、厚切りの切片への適応が可能であるが、FISHは既知の配列を検出する方法であり、現状ではランダムな未知の塩基配列を検出に利用する事はできなかった。
そこで本研究では、FISHを用いてランダムなバーコード列を検出する方法を開発した。既知のバーコードを用意し、ランダムに接続する方法を用いると、多様性をもったバーコードの配列が生成できる。このバーコード配列は、分割した複数のFISHプローブを結合させる方法により、増幅できる。増幅された長い一本鎖DNA(Rolony)に含まれるバーコードは、繰り返しの染色・洗浄によって読みだされるが、常に同じ粒状の空間パターンを持つため、複数のバーコード列を持つウィルスが感染していても、分離して検出する事ができる事がわかった。よって本研究により、逆行性バーコーディングの技術が開発された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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