| 研究領域 | クロススケール新生物学 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H05549
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
村越 秀治 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円)
2023年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
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| キーワード | シナプス / 蛍光寿命イメージング / 光操作 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究ではCdc42の活性化因子（GEF）に着目し、CaMKII-Cdc42活性変換メカニズムを明らかにする。Cdc42の活性化因子（GEF）の候補は70種類程度あり、研究対象とするには膨大である。しかしながら最近、GEFの特異性の網羅的解析や発現量のデータベースを活用することで候補分子を70種類から6種類にまで絞り込むことができた。そこで本研究では、これら６種類のGEF分子に着目し、我々が独自開発した光応答性分子による局所光操作技術や2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡で定量解析する。
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| 研究実績の概要 |
Cdc42はスパイン内での光応答性CaMKII活性化により活性化される（Shibata et al. 2021）。すなわち、光応答性CaMKII活性化に応じてスパインにリクルートされるCdc42の活性化因子（70種類のGEF）の中から分子を同定すれば、それがCdc42を活性化させる変換因子である可能性がある。そこで、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡法（2pFLIM）を用いて各分子がスパインにリクルートされるかどうかをサブスパインの空間分解能でしかも定量的に調べることにした。具体的には、各候補分子を短い蛍光寿命（0.82ナノ秒）をもつ蛍光タンパク質BrUSLEEでタグ付けした。このプローブを、長い蛍光寿命（2.6ナノ秒）をもつEGFPと海馬神経細胞に共発現させた。そして、1000 nmの2光子励起で2pFLIMを行いながら、720 nmの2光子励起でケイジドグルタミン酸でLTPを誘起した。この方法を用いた予備的な結果として、研究代表者は候補分子の中から、LTP依存的にスパインにリクルートされる分子のイメージングに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、各候補分子を短い蛍光寿命をもつ蛍光タンパク質BrUSLEEのタグ付けを進め、EGFPと海馬神経細胞に共発現させることに成功した。また、2pFLIMで、候補分子の中から、LTP依存的にスパインにリクルートされる分子のイメージングに成功しており、研究は極めて順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
Cdc42の活性化因子GEFは75種類以上存在するが、研究代表者は最新のデータベースを利用して、Cdc42に対する特異性と海馬でのmRNA発現量の観点から、6種類のGEFに着目している。今後は上記で述べたように蛍光タンパク質BrUSLEE と2pFLIMを用いて、これら6種類の分子の局在と機能を調べる。
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