| 研究領域 | 非ドメイン型バイオポリマーの生物学：生物の柔軟な機能獲得戦略 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H05598
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
加藤 泰彦 大阪大学, 大学院工学研究科, 准教授 (60415932)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
9,360千円 (直接経費: 7,200千円、間接経費: 2,160千円)
2023年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
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| キーワード | 長鎖ノンコーディングRNA / ミジンコ / 性決定 / ダブルセックス遺伝子 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
RNA は特定の構造をとらず柔軟に機能を発揮することが知られているが、同一の RNA が異なる生理機能を発揮するメカニズムの理解は遅れている。本研究では、ミジンコの性決定を制御する新奇のRNA配列が性決定遺伝子 Dsx1 の mRNA の一部として、また lncRNA の一部として核内外で機能する機構を明らかにする。本研究により RNA 型非ドメインバイオポリマーの動作原理の解明につながるだけでなく、新規の性決定制御機構の獲得戦略が明らかになる。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ミジンコにおいて性決定遺伝子の Dsx1 mRNA の 5´ UTR として、また Dsx1 を活性化する lncRNA の一部として核内及び細胞質内で異なる機能を有する「性決定の作動 RNA」を対象としてそれぞれの機能が発揮される機構を明らかにするために、作動 RNA の 2 次構造の解析、作動 RNA 結合タンパク質の解析を進めた。まず 205 塩基からなる作動 RNA の 2 次構造を in silico で予測すると、5´ 側の約 170 塩基で大きなステムループ構造が、また3´ 側の約 30 塩基によってもステムループ構造が形成されることがわかった。 続いて作動 RNA を 5 つの領域に分け、各領域の Dsx1 活性化能を解析したところ、3' 側のステムループ構造を持つ領域が Dsx1 活性化能を有することが判明した。Dimethyl sulfate (DMS) を用いて in vitro、in vivo で形成される 2 次構造を明らかにするために、それぞれの解析に適した DMS 処理濃度、時間を検討し、必要な DMS 処理条件を見出した。一方で、作動 RNA 結合タンパク質の解析に用いる CRISPR 依存的 RNA-タンパク質間相互作用検出（CAPRID）法において使用する Cas タンパク質として、2021年に報告されたコラテラル活性を示さない Cas7-11 を検討した。GFP を発現する形質転換体の GFP mRNA を標的として crRNA を設計し、これを Cas7-11 mRNA と卵に共注入した。その結果、crRNA 依存的な GFP mRNA の分解が生じることを見出し Cas7-11 がミジンコ体内で機能することが判明した。これにより、ミジンコにおける CAPRID 法を用いた RNA 結合タンパク質解析のための道が拓けた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2 次構造解析においては、当初の予定を変更して性決定作動 RNA の機能エレメントの探索を先に進めたため DMS を利用した 2 次構造決定までは至らなかったが、DMS 処理の条件検討も済み、2 次構造解析のための準備は整った。一方で、CAPRID 法を用いた RNA 結合タンパク質の解析においても、当初利用することを予定していた CasRX で問題となっていたコラテラル活性を有さない Cas7-11 が報告されたため、予定を変更し Cas7-11 を利用することとした。ミジンコ個体内での活性の確認に時間を要したが、CAPRID 法を実行するための基盤は整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り、DMS 処理による作動 RNA の 2 次構造解析、また CAPRID 法を用いた作動 RNA への結合タンパク質の同定を進める。
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