| 研究領域 | 非ドメイン型バイオポリマーの生物学：生物の柔軟な機能獲得戦略 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H05606
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
井手 聖 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 助教 (50534567)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
9,620千円 (直接経費: 7,400千円、間接経費: 2,220千円)
2023年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2022年度: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
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| キーワード | 核小体 / 液ー液相分離 / 相転移 / ノンコーディングRNA / 非コードRNA / RNAポリメラーゼI / コンデンセート |
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| 研究開始時の研究の概要 |
核小体は、非ドメイン型バイオポリマーが集約し液―液相分離によって形成される非膜オルガネラである。本研究ではヒートショックなどのストレス時における核小体のアミロイド様化に注目し、RNAポリメラーゼIにより合成される非ドメイン型ノンコーディングRNAが核小体の相転移を制御する仕組みを明らかにする。これを通して非ドメイン型バイオポリマーがどのように機能を獲得するのかを理解することに貢献する。
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| 研究実績の概要 |
核小体は、非ドメイン型バイオポリマーが集約し液―液相分離によって形成される非膜オルガネラである。研究代表者は、細胞内一分子イメージング法によりリボソーム合成時にRNAポリメラーゼI（Pol I）が局在する核小体内層(FC)が大量のリボソームRNA(rRNA)のため、相分離を起こした液滴（ドロプレット）というよりむしろ、より粘性の高いゲル状になることを見出している。本研究ではヒートショックなどのストレス時における核小体のアミロイド様化に注目し、Pol Iにより合成される非ドメイン型ノンコーディングRNA(ncRNA)が核小体の相転移を制御する仕組みを明らかにすることを目的とした。令和4年度はストレス時にPol Iが本来の鋳型rRNA遺伝子以外のゲノム領域から合成するncRNAを網羅的に同定することを試みた。異なる方法でPol Iをノックダウンし、RNAシーケンス（RNA-seq）をした。その結果、予備実験により見出した有力な候補も含め再現性が高く減少するncRNAが見つからなかった。今後、リピート配列を含んだヒト完全ゲノムT2Tをリファレンスとして用いたRNA-seq解析を行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
これまでncRNAがPol I依存的に合成されるかどうかをタンパク質分解除去できるAID法によってPol Iをノックダウンした時その量が減少することを指標に評価し、候補となるncRNAを特定してきた。この結果を異なるアプローチで確認した。具体的にはPol Iの転写に必須なクロマチン因子UBFに依存的に新規合成されるncRNAを特定することにした。Pol Iと同様に、UBFをAID法によって迅速に分解できる細胞株を用いて、アミロイド様凝集体を誘発した時にUBFノックダウンとともにその発現が減少するncRNAを次世代シークエンサーで網羅的に同定することを試みた。ところが、Pol I依存的に合成されるncRNAの有力候補であると考えていたヒストン遺伝子クラスター領域のncRNAが検出できなかった。さらに予備実験に使用した株とは独立に作製したPol Iノックダウン細胞株においても確認したところ、ヒストン遺伝子クラスター領域由来のncRNAの低下は観察されなかった。そこでストレス応答時、Pol Iがヒストン遺伝子クラスター領域を転写しているかを明らかにするために、Pol IとHLBマーカータンパク質NPATの経時観察した。その結果、ストレス時に２つの輝点が近接したり、共局在する様子は見られなかった。このことから、有力候補であるヒストン領域由来のncRNAがPol Iで転写されたものでないと結論付けた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、Pol Iによって転写されるncRNAを同定するために、Pol Iをノックダウンした時のRNA-seqデータとUBFをノックダウンした時のRNA-seqデータで共通してその発現が減少しているものを調べていく。これまでRNA-seq解析の際にリファレンスとしてヒトゲノムhg38を使用してきたが、最近公表された完全ヒトゲノムT2Tを用いる。T2Tゲノムはこれまでのリファレンスで除外されていたテロメア、セントロメア、rRNA遺伝子の周りのリピート配列を含んでおり、これらリピート配列も対象にし調べていく。
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