聴・平衡覚器官のイメージング解析～１分子から個体レベルまで～

• 研究領域: 細胞機能と分子活性の多次元蛍光生体イメージング
• 研究課題/領域番号: 23113511
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2013-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 11,440千円 (直接経費: 8,800千円、間接経費: 2,640千円); 2012年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円); 2011年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
• キーワード: 内耳 / イメージング / 難聴 / cdc42 / 聴覚 / 平衡覚

研究実績の概要

驚くほど多数の老人性難聴の患者が存在するにもかかわらず、内耳の機能異常・病態の研究は、内耳が微細な構造体であることから、十分に進んでいない。本研究では、内耳特異的KOマウスを用いて、イメージング手法（個体～1分子）を駆使することにより、内耳疾患の新規治療法の開発に繋がるような新しい研究法を確立しようというものである。
本年度は進行性の高度難聴（80 dB）を呈する内耳有毛細胞特異的Cdc42ノックアウト（KO)マウスを作製し、難聴発症機序の解明を試みた。Cdc42 KO聴覚有毛細胞の電子顕微鏡解析では、聴毛の欠落・癒合が認められた。蝸牛の有毛細胞ではGFP-Cdc42は、聴毛を覆う形質膜と頂側に近い側壁に局在した。聴覚有毛細胞のモデル細胞として用いたMDCK細胞では、1) GFP-Cdc42はcyst管腔に面する頂側面と頂側に近い側壁に局在し、2) Cdc42-ノックダウン（KD）安定細胞株では、微絨毛の減少や癒合とTight junction (TJ) のマーカーであるZO1の細胞内停留が認められた。2) TJの形態異常はKOマウスの聴覚有毛細胞（電顕）でも確認できた。Cdc42 FRET biosensor TG miceの聴覚有毛細胞を用いた二光子蛍光顕微鏡観察では、Cdc42は、聴毛膜の先端部で強い、頂側に近い側壁で弱い活性化を示した。Cdc42-KD細胞株における細胞内シグナルに関しては、CofilinとMyosin phosphatase 1 (MYPT1) のリン酸化亢進に代表されるアクチン代謝障害と代償経路の活性化 (RhoA→ROCK→ LIMK2→Cofilin, RhoA→ROCK→MYPT1→MLC) が観察された。
以上より、Cdc42 KOマウスの進行性難聴は、聴覚有毛細胞内の聴毛及びTJでのアクチン代謝障害に起因することを明らかにした。

現在までの達成度 (段落)

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Both C1B domain and pseudosubstrate region are necessary for saturated fatty acid membrane;distinct role of intramolecular domains for different (2013)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Nishimoto, T., Kashiwagi, K., Saito, N., and Shirai, Y.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 432 号: 2 ページ: 384-388
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.01.048
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel PKC#61537;-mediated phosphorylation site(s) on cofilin and their potential role in terminating histamine release" (2012)
  • 著者名/発表者名: Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K^I., Kuramasu, M., Nakamura, T., Yanagita, T., Mizuno, K., Hide, I., Nakata, Y., Saito, N.
  • 雑誌名: Mol Biol. Cell 巻: 23 ページ: 3707-3721
  • 査読あり
• [雑誌論文] MARCKS dephosphorylation is involved in bradykinin-induced neurite outgrowth in neuroblastoma SH-SY5Y cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tanabe A, Shiraishi M, Negishi M, Saito N, Tanabe M, and Sasaki Y.
  • 雑誌名: J Cell Physiol. 巻: 227 号: 2 ページ: 618-629
  • DOI: 10.1002/jcp.22763
  • 査読あり
• [雑誌論文] c-Abl tyros ine kinase regulates serum-induced nuclear export of diacylglycerol kinase α by phosphorylation at Tyr218 (2012)
  • 著者名/発表者名: Matsubara T, Ikeda M, Kiso Y, Sakuma M, Yoshino K-I, Sakane F, Merida I, Saito N, Shirai Y
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 巻: 287 ページ: 5507-5517
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of a novel fluorescence-based method to evaluate chaperone-mediate autophagy in a singlz neuron (2011)
  • 著者名/発表者名: Seki, T., Ki Y., Tanaka, S., Dohi, E., Onji, T., Yamamoto, K., Seki T, Yoshino KI, Tanaka S, Dohi E, Onji T, Yamamoto K, Hide, I., Sakai, N. et al.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 7 号: 2 ページ: e31232-e31232
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0031232
  • 査読あり
• [雑誌論文] c-Abl tyrosine kinase regulates serum-induced nuclear export of diacylglycerol kinase α by phosphorylation at Tyr218 (2011)
  • 著者名/発表者名: Matsubara, M., Ikeda, M., Kiso, Y., Sakuma, M., Sakane, F., Merida, I, Saito, N., Shirai, Y.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem 巻: 287 号: 8 ページ: 5507-5517
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.296897
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cooperation of p40phox with p47phox for Nox2 activation during FcgR-mediated phagocytosis--Mechanism for acquisition of p40phox PI(3)P binding-- (2011)
  • 著者名/発表者名: Ueyama T, Nakakita J, Nakamura T, Kobayashi T, Kobayashi T, Son J-h, Sakuma M, Sakaguchi H, Leto T, Saito N
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 巻: 286 ページ: 40693-40705
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct binding of RalA to PKCh and its crucial role in morphological change during keratinocytes differentiation (2011)
  • 著者名/発表者名: Shirai Y, Morioka S, Sakuma M, Yoshino K, Otsuji C, Sakai N, Kashiwagi K, Chida K, Shirakawa R, Horiuchi H, Nishigori C, Ueyama T, Saito N
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 巻: 22 ページ: 1340-1352
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nuclear Choline Acetyltransferase Activates Transcription of a High-affinity Choline Transporter (2011)
  • 著者名/発表者名: Matsuo, A., Bellier, J-P, Nishimura, M., Yasuhara, O., Saito, N., Kimura, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 巻: 286 ページ: 5836-5845
  • 査読あり
• [学会発表] 黒質線条体系におけるPKC#61543;の基質の解析：ドパミン遊離における#61538;PIXリン酸化の (2013)
  • 著者名/発表者名: 白藤 俊彦、上山 健彦、吉野 健一、足立 直子、高橋 英之、吾郷 由希夫、
  • 学会等名: 第86回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2013-03-21
• [学会発表] Duoxの活性酸素産生機構 (2013)
  • 著者名/発表者名: 佐久間 恵、上山 健彦、濵田 猛、齋藤 尚亮
  • 学会等名: 第86回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2013-03-21
• [学会発表] Role of PKCalpha-mediated cofilin phosphorylation in the degranulation from (2012)
  • 著者名/発表者名: Sakuma, M., Shirai, Y., Yoshino, K., Kuramasu, M., Nakamura, T., Mizuno, K.,
  • 学会等名: 22th IUBMB 37th FEBS
  • 発表場所: Madrid
  • 年月日: 2012-09-04
• [学会発表] Glial functions of Rho-family small GTPases during cerebellar development and (2012)
  • 著者名/発表者名: Ueyama,T., Kondoh T., Kohta M., Kohmura,E., Hayashibe,M., Nakamura,T.,
  • 学会等名: 14th International congress of histochemistry and cytochemistry
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 2012-08-26
• [学会発表] Involvment of PKCgamma in neurodegenerative disease (2012)
  • 著者名/発表者名: Saito, N., Takahashi, H., Shirafuji, T., Adachi, N., Danno, S., Ueyama, T.,
  • 学会等名: 14th International congress of histochemistry and cytochemistry
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 2012-08-26
• [学会発表] 細胞内シグナル分子の可視化と細胞機能 (2012)
  • 著者名/発表者名: 齋藤尚亮
  • 学会等名: 第89回日本生理学大会
  • 発表場所: 松本