ランダムスキャン２光子励起顕微鏡による神経細胞機能の可視化

公募研究

研究領域	細胞機能と分子活性の多次元蛍光生体イメージング
研究課題/領域番号	23113515
研究種目	新学術領域研究(研究領域提案型)
配分区分	補助金
審査区分	生物系
研究機関	早稲田大学
研究代表者	井上貴文早稲田大学, 理工学術院, 教授 (10262081)
研究期間 (年度)	2011-04-01 – 2013-03-31
研究課題ステータス	完了 (2012年度)
配分額 *注記	22,100千円 (直接経費: 17,000千円、間接経費: 5,100千円) 2012年度: 11,050千円 (直接経費: 8,500千円、間接経費: 2,550千円) 2011年度: 11,050千円 (直接経費: 8,500千円、間接経費: 2,550千円)
キーワード	蛍光相関分光法 / タンパク質 / 拡散 / 樹状突起 / スパイン / 2光子励起顕微鏡 / 神経細胞 / 分子・細胞神経科学 / タンパク質の動態
研究実績の概要	本研究は申請者の開発したランダムアクセス型2光子励起顕微鏡システムを用いて、これまで困難だった遊離タンパク質の動態を直接計測することを目指す。多点で同時に蛍光相関分光法(FCS)を適用することにより樹状突起の細胞質中を高速に移動するタンパク質分子の動態を捉え、シナプスと核を連絡するシグナル系の実態を明らかにすることを目的とする。これまで細胞質内を拡散する遊離型タンパク質は拡散速度の桁違いの大きさのため直接的な動態の計測は困難だった。蛍光相関分光法(FCS)は溶液中での一分子の振る舞いを計測する手法で、これを細胞内に適応することにより細胞質内の遊離タンパク質の挙動を追跡できる。しかし従来のFCS装置は細胞内の一点からしか記録できず、細胞内の様々な部位における機能タンパク質の動態解析を行うには制約があった。特に神経細胞は細胞内の機能局在性が高く、同時多点からのFCS解析は非常に多くの情報をもたらすことが期待される。本研究では新規に開発した2光子励起顕微鏡システムを用いカルモジュリン、CamKII、Ca結合タンパク質(calbindin等)などシナプス機能に重大な機能分子のスパイン内外での動態を検出することを試みた。本年度は初代培養神経細胞を用いて樹状突起およびスパイン内のタンパク質のFCS計測を試みた。GFP発現プラスミドあるいはGFP融合CamKIIタンパク質発現プラスミドをマウス由来初代培養神経細胞に発現させ細胞質の複数点から蛍光強度変化を10kHz以上の時解像度で取得することに成功した。自己相関関数よりタンパク質の細胞局所での拡散係数が異なることを見いだした。
現在までの達成度 (段落)	24年度が最終年度であるため、記入しない。
今後の研究の推進方策	24年度が最終年度であるため、記入しない。