リコンビナーゼとその活性化因子との複合体構造を通した鎖交換反応の構造基盤の確立

公募研究

研究領域	細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
研究課題/領域番号	23121508
研究種目	新学術領域研究(研究領域提案型)
配分区分	補助金
審査区分	生物系
研究機関	東京大学
研究代表者	清水敏之東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (30273858)
研究期間 (年度)	2011
研究課題ステータス	完了 (2011年度)
配分額 *注記	4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円) 2011年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
キーワード	相同組み換え / メディエーター / リコンビナーゼ / Swi5-Sfr1
研究概要	全長のSwi5-Sfr1を大腸菌で発現させたところ、十分な量の発現がみられ、さらに純度よく精製することも可能であった。このサンプルをもとに結晶化も行ってきたが結晶が得られていない。Sfr1には構造をもたないと予想される領域が存在するため、安定なドメインを見つけるためにプロテアーゼ消化を行った。その結果Sfr1のN末端側は比較的切断されやすいことを見出した。そこでSfr1のN末側を約半分削ったコンストラクト(Sfr1C)を数種類作成し、Swi5と共発現させて発現・精製を試みた。その結果複合体の形(Swi5-Sfr1C)で純度よく精製することが可能であった。結晶化を試みたところ、最終的に分解能2.2Åの回折像が得られるような結晶が得られた。この結晶の空間群はP2_12_12で格子定数はa=88.2Å,b=128.7Å,c=60.0Åであった。この結晶中には非対称単位中に2複合体が存在している。位相を決定するためにセレノメチオニン置換体の試料を調整し、この置換体でも結晶を得ることに成功した。なお、Swi5-Sfr1Cはほぼ全長と同等の組み換え活性があることは確認している。セレノメチオニン置換体のデータをもとに単波長異常分散法により初期の電子密度を得ており、現在はこの電子密度をもとにモデリングを行っている。Swi5-Sfr1Cは非常に細長い構造をとっており、両者のタンパク質にあるαヘリックスがロイシンジッパー構造を形成してヘテロ二量体化していた。また途中で大きく屈曲している領域があり、全体としてはブーメランのような構造をしている。