毒素タンパク質のシグナル伝達活性化メカニズムの構造的基盤

• 研究領域: 細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
• 研究課題/領域番号: 23121515
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 京都工芸繊維大学
• 研究代表者: 北所 健悟 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 准教授 (60283587)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2013-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2012年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円); 2011年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
• キーワード: シグナル伝達 / 感染症 / パスツレラ毒素 / X線構造解析 / 分子認識 / 結晶化 / GTPase

研究実績の概要

PMT活性発現領域(C-PMT)とGαi2ペプチド複合体の結晶化および立体構造の解析
C-PMT変異体並びにGi2αサブユニット(Gαi2)については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製することができた。既に結晶構造を決定した変異体（3種類；C1159S, C1165S, C1159SC1165Sダブルミュータント）を用いて、この標的分子のGαi2の認識部分の（20 アミノ酸；IFRMVDVGGQRSERRKWIH並びにその類縁ペプチド）との複合体結晶を数種類作成し、SPring-8において回折データ測定を行った。種々の結晶化スクリーニングの結果、Native 結晶とは結晶化条件や形状並びに空間群など結晶系の異なる数種類の共結晶を得ることができた。構造解析の結果、Gタンパク質の脱アミド化修飾を受けるGln残基のN末端側に存在する2つのGly残基、1つのVal残基がPMTの活性中心付近のクレフト内で相互作用することで、結合に関与していることが明らかになった。
C-PMTとヘテロ三量体GTP結合タンパク質Gαi2の複合体の結晶化
C-PMT並びにGαi2については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製した。C-PMT とGαi2との複合体結晶を、数種類の異なる沈殿剤の条件下で作成した。不活型のC-PMT(C1165S並びにC1159SC1165Sダブルミュータント) とGαi2との複合体結晶のスクリーニングについて結晶化を行った。予備的な結晶化条件から、濃縮方法を検討し、C-PMTとGタンパク質複合体の結晶化を行ったところ、リン酸共存下で複合体状態での結晶を確認することに成功した。

現在までの達成度 (段落)

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Visualization of mitochondria in living cells with a genetically encoded yellow fluorescent protein originating from a yellow-emitting luminous bacterium. (2013)
  • 著者名/発表者名: Karatani H, (他8 名、8 番目)
  • 雑誌名: Photochem Photobiol Sci. 巻: Epub ahead of print 号: 5 ページ: 944-956
  • DOI: 10.1039/c3pp25360k
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of cutinase Est119 from Thermobifida alba AHK119 that can degrade modified polyethylene terephthalate at 1.7A resolution. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kitadokoro K, (他 6 名、1 番目)
  • 雑誌名: Polym.Degrad.Stab., 巻: 97 号: 5 ページ: 771-775
  • DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2012.02.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal Structure of Clostridiumperfringensenterotoxin displays features of β-pore-forming toxins (2011)
  • 著者名/発表者名: Kitadokoro, K., Nishimura, K., Kamitani, S., Fukui-Miyazaki, A., Toshima, H., Abe, H., Kamata, Y., Sugita-Konishi, Y., Yamamoto, S., Karatani, H., and Horiguchi, Y
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286 号: 22 ページ: 19549-19555
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.228478
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic studies on the HA3 subcomponent of type B botulinumneurotoxin complex (2011)
  • 著者名/発表者名: Nishimura K, Kitadokoro K, Takegahara Y, Sugawara Y, Matsumura T, Karatani H, Fujinaga Y
  • 雑誌名: ActaCryst.F 巻: 67 号: 10 ページ: 1244-1246
  • DOI: 10.1107/s1744309111027412
  • 査読あり
• [雑誌論文] A histone-like protein of mycobacteria possesses ferritin superfamily protein-like activity and protects against DNA damage by Fenton reaction (2011)
  • 著者名/発表者名: Takatsuka M, Osada-Oka M, Satoh EF, Kitadokoro K, Nishiuchi Y, Niki M, et al
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 6 号: 6 ページ: e20985-e20985
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0020985
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzymatic actions of Pasteurella multocida toxin detected by monoclonal antibody recognizing the deamidated alpha subunit of the heterotrimeric GTPase Gq (2011)
  • 著者名/発表者名: Kamitani, S., Ao, S., Toshima, H., Tachibana, T., Hashimoto, M., Kitadokoro, K., Fukui-Miyazaki, A., Abe, H., and Horiguchi, Y.
  • 雑誌名: FEBS J 巻: 278 号: 15 ページ: 2702-2712
  • DOI: 10.1111/j.1742-4658.2011.08197.x
  • 査読あり
• [学会発表] B型ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンのX線結晶構造解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 阿松翔, 菅原庸, 松村拓大, 柄谷肇, 藤永由佳子, 北所健悟
  • 学会等名: 第59回 毒素シンポジウム
  • 発表場所: 北海道・帯広・とかちプラザ
  • 年月日: 2012-08-30
• [学会発表] B型ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンのX線結晶構造解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 阿松翔, 菅原庸, 松村拓大, 柄谷肇, 藤永由佳子, 北所健悟
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場
  • 年月日: 2012-06-20
• [学会発表] ウェルシュ菌の産生する食中毒病原因子CPEの構造および機能解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 西村昂亮・神谷重樹・福井理・戸嶋ひろ野・安倍裕順・鎌田洋一・小西良子・山本茂貴・柄谷肇・堀口安彦・北所健悟
  • 学会等名: 日本結晶学会総会・平成23年度年会および総会
  • 発表場所: 北海道大学
  • 年月日: 2011-11-24