複合体構造解析によるＡＤＰリボシル化毒素の標的タンパク質認識機構の解明

• 研究領域: 細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
• 研究課題/領域番号: 23121529
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 京都産業大学
• 研究代表者: 津下 英明 京都産業大学, 公私立大学の部局等, 教授 (40299342)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2013-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2012年度)
• 配分額: 8,840千円 (直接経費: 6,800千円、間接経費: 2,040千円); 2012年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2011年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
• キーワード: 細菌 / ADPリボシル化 / 毒素 / 複合体構造 / アクチン / ホスト認識 / 反応機構 / C3 / RhoA / Ia / モノADPリボシル化 / 複合体結晶構造解析 / 特異性

研究実績の概要

ウェルシュ菌由来の二成分毒素Iota毒素（モノADPリボシル化酵素：Iaサブユニット）はアクチンを標的としてモノADPリボシルを起こし、Arg177を修飾する事でアクチンの重合を阻害し、細胞毒性を示すことが知られている。我々はその機能を理解するために毒素とヒト基質タンパクであるアクチンの複合体の結晶構造を非水解性の基質アナログβTADを挟んで、明らかにしている（Tsuge et al. PNAS 2008)。しかしながら、本来の基質であるNAD＋が結合した状態またモノADPリボシル化の反応が進んだ反応後の構造はわかっていなかった。
今回我々はアポIa-アクチンの複合体の大きな結晶を作成し、結晶を凍結させるべく使用した、エチレングリコールを含んだ母液がモノADPリボシル化反応を抑える事を見いだした。これを利用して結晶をソーキングし、反応の前と後に相当するNAD+-Ia-actinとIa-ADP-ribosylated (ADPR)-actinの複合体結晶構造を高い分解能で明らかにした（1.7 および2.2 オングストローム)。また、反応に重要なアミノ酸E378とE380の点変異体を作り、このNAD+-Ia（mutant)-actinでの結晶構造も明らかにした（Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 12;110(11):4267-72.）。
その反応は、まずNAD+からSn1反応により、ニコチンアミドが切れ、オキソカルベニウムカチオン中間体ができ、さらに第２の中間体を経て、アクチンのアルギニン177に近づき、ADPリボシル化の修飾反応が起きると考えられた。第一中間体では構造的緊張（strain)した状態であり、此れが緩和(alleviation)する事により反応が進むstrain-alleviation　modelを提唱した。

現在までの達成度 (段落)

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Arginine ADP-ribosylation Mechanism Based on Structural Snapshots of Iota-toxin and Actin Complex. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tsurumura, T., Tsumori, Y., Qiu, H., Oda, M., Sakurai, J., Nagahama, M., Tsuge, H.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 巻: 110 号: 11 ページ: 4267-4272
  • DOI: 10.1073/pnas.1217227110
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structures of dye-decolorizing peroxidase with ascorbic acid and 2,6-dimethoxyphenol. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 586(24) ページ: 4351-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of sphingomyelinase in infectious diseases caused by Bacillus cereus. (2012)
  • 著者名/発表者名: Oda M
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 7(6)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of side-edge site of sphingomyelinase from Bacillus cereus. (2012)
  • 著者名/発表者名: Oda M
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 422(1) ページ: 128-32
  • 査読あり
• [雑誌論文] The catalytic mechanism of dye-decolorizing peroxidase DyP may require the swinging movement of an aspartic acid residue (2011)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Tsuge H, Konno H, Hisabori T, Sugano Y
  • 雑誌名: FEBS.J 巻: 278 ページ: 2387-2394
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure and stability of Gyuba, β-lactoglobulin chimera (2011)
  • 著者名/発表者名: Ohtomo H, Konuma T, Utsunomiya H, Tsuge H, Ikeguchi M
  • 雑誌名: Protein Sci 巻: 20(11) 号: 11 ページ: 1867-75
  • DOI: 10.1002/pro.720
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of free reduced flavin generation by flavin reductase from Thermus thermophilus HB8 (2011)
  • 著者名/発表者名: Imagawa T, Tsurumura T, Sugimoto Y, Aki K, Ishidoh K, Kuramitsu S, Tsuge H
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 286(51) ページ: 44078-44085
  • 査読あり
• [学会発表] 感染症を理解するための構造生物学 (2013)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: 細菌学会
  • 発表場所: 浦安
  • 年月日: 2013-03-18
  • 招待講演
• [学会発表] モノアシルグリセロールリパーゼの二量体形成はその機能に重要か? (2012)
  • 著者名/発表者名: 鶴村俊治
  • 学会等名: 生化学会
  • 発表場所: 博多
  • 年月日: 2012-12-15
• [学会発表] インフルエンザウィルスRNAポリメラーゼPB2のX線結晶構造解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 秋こう
  • 学会等名: 生化学会
  • 発表場所: 博多
  • 年月日: 2012-12-15
• [学会発表] アルギニンADPリボシル化初めての可視化 (2012)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: ビタミンB研究協議会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012-11-17
• [学会発表] Actin Recognition and ADP-ribosylation of C. perfringens iota-toxin (2012)
  • 著者名/発表者名: Hideaki Tsuge
  • 学会等名: The 11th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 発表場所: 淡路
  • 年月日: 2012-09-13
• [学会発表] アクチン ADP リボシル化反応に伴う酵素の構造変化 (2012)
  • 著者名/発表者名: 鶴村俊治
  • 学会等名: タンパク質科学会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2012-06-21
• [学会発表] ADPリボシル化反応に伴う酵素の構造変化 (2012)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: ビタミンB研究協議会
  • 発表場所: 京都国際交流会館
  • 年月日: 2012-02-04
• [学会発表] ADPリボシル化毒素構造研究の最前線 (2011)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: シンポジウム「疾患治療に用いる天然有機化合物の生合成遺伝子の包括的理解」
  • 発表場所: 徳島文理大学(招待講演)
  • 年月日: 2011-12-22
• [学会発表] アクチンADPリボシル化の構造基盤 (2011)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: 生化学会
  • 発表場所: 京都国際会館(招待講演)
  • 年月日: 2011-09-21
• [学会発表] 感染症因子とヒトタンパク質の相互作用を見る (2011)
  • 著者名/発表者名: 津下英明
  • 学会等名: X線の会
  • 発表場所: 阪急グランドビル(招待講演)
  • 年月日: 2011-09-10
• [学会発表] ADPリボシル化毒素によるアクチン認識の特異性解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 鶴村俊治、津下英明
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
  • 発表場所: 大阪府吹田市
• [学会発表] Crystal structure of Ia-Actin complex with novel ligand (2011)
  • 著者名/発表者名: Tsurumura T., Tsuge H.
  • 学会等名: IUCr(国際結晶学会)
  • 発表場所: Madrid Spain
• [学会発表] Structural basis for the Helicobacter pylori-carcinogenic TNF-alpha-inducing protein (2011)
  • 著者名/発表者名: Tsurumura T., Tsuge H.
  • 学会等名: IUCr,(国際結晶学会)
  • 発表場所: Madrid Spain
• [備考] 米国科学アカデミー紀要（PNAS）でCommentaryが掲載されました
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20130314_news.html
• [備考] 米国科学アカデミー紀要（PNAS）のオンライン版に掲載
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20130131_news.html
• [備考]
  • URL: http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~tsuge/Home_Japanese.html