| 研究領域 | 不均一環境変動に対する植物のレジリエンスを支える多層的情報統御の分子機構 |
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| 研究課題/領域番号 |
23H04193
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
城所 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (70588368)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円)
2024年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2023年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
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| キーワード | 植物 / 温度ストレス応答 / ゲノム編集ツール / 温度ストレス / ゲノム編集 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
植物が生命を脅かす気温変化(低温・高温ストレス)に晒されると、耐性遺伝子の発現を急速に誘導することでストレスを耐え凌ぐレジリエンス機構を持つ。これまでに、常温時に概日時計で働く転写因子群が低温・高温ストレス時の遺伝子発現誘導を制御すること、またストレスに応答した翻訳後制御を受けることを明らかにしてきた。そこで本計画研究では、ゲノム編集ツールを組み合わせたプロテオミクス解析やイメージング技術を用いて、概日時計転写因子が常温・低温・高温においてそれぞれの標的遺伝子の発現を制御する分子機構を解析することで、不均一な温度環境において植物が成長とストレス耐性とを柔軟に切り替えるメカニズムの解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
常温・低温・高温におけるRVE転写因子の標的プロモーター上で起こる転写制御の分子機構を明らかにするため、温度への応答性が異なる4つのRVE4/RVE8標的遺伝子のプロモーター内において4~6種類のgRNAを設計した。各gRNAとともdCas9と転写活性化因子をシロイヌナズナプロトプラスト内で一過的に発現させ、標的プロモーターの転写活性を測定した。その結果、それぞれのプロモーターにつき1~2種類のgRNAで高い転写活性化能が見られた。また活性が見られた2種類のgRNAを同時に発現させて同様の実験を行った結果、転写活性化能の相乗的な向上が見られた。
次に、各プロモーターにおいて転写活性化能が見られたgRNAと3×FLAG-dCas9を発現するシロイヌナズナ植物体を作出した。また複数のgRNAをtRNA-Glyで繋ぐことで同時に発現させた3×FLAG-dCas9形質転換体も作出した。さらにMS2アプタマー融合型gRNAおよびSunTagシステムを用いて1分子のgRNA-dCas9複合体に対して多数のGFPタンパク質を相互作用させるCRISPR-IMSベクターを構築し、シロイヌナズナ植物体に導入した。
RVE標的プロモーターの1つについてgRNAを含むCRISPR-IMSベクターを導入した植物体を用いて蛍光観察を行った結果、根において核内で顆粒状のシグナルが検出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
dCas9を用いたプロモーターのラベルを行うためのコンストラクトやgRNA評価系を構築し、標的プロモーターにおけるgRNAの選抜と植物体への導入を計画通り進めることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
各プロモーターのgRNAと3×FLAG-dCas9を発現させた植物体を用いたenChIPを行い、質量分析装置を用いて共免疫沈降産物を同定する。通常生育条件だけでなく低温・高温ストレス条件下での植物体について同様の解析を行い、共精製産物やそれらの修飾状態を比較する。
イメージング解析については、他のプロモーターのgRNAを含むCRISPR-IMSベクターを導入した植物体の作出と蛍光観察を進めるとともに、別のアプタマーやタグシステムを用いた新規イメージング用ベクターを構築することで、地上部の細胞でも蛍光が見られるシステムの開発を目指す。
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