核膜孔テリトリーにおけるゲノムモダリティ2.0

• 研究領域: ＤＮＡの物性から理解するゲノムモダリティ
• 研究課題/領域番号: 23H04278
• 研究種目: 学術変革領域研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 学術変革領域研究区分(Ⅲ)
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: WONG W・R 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 教授 (30464035)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 13,000千円 (直接経費: 10,000千円、間接経費: 3,000千円); 2024年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円); 2023年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
• キーワード: 核膜孔 / ゲノムモダリティ / 高速AFM / 核膜孔複合体 / 高速原間力顕微鏡

研究開始時の研究の概要

核膜は真核生物のゲノムを取り囲み細胞核を形作る。核膜には孔が開いており、その孔を構成する核膜孔複合体（NPC）を通じ、核内外へのサプライチェーンを制御していることが知られている。ゲノムDNAに刻まれた遺伝情報を読み出す遺伝子発現は、生命現象を支える基盤機構であり、生命の維持や機能発現に重要である。本研究では、核膜孔近傍におけるゲノム構造形成に至るDNAダイナミクスをシームレスに解明する。また、計画班メンバーとの新たなコラボレーションを構築し、他のメンバーの研究をサポートする。本課題で得られるDNA物性・ナノ動態情報は、ゲノムモダリティの理論構築の基盤データとしての活用が期待される。

研究実績の概要

核膜孔複合体（NPC）は、核膜を貫き、DNA情報を伝達する核膜孔を形成する30種類のタンパク質から成り立ちます。NPCは約30種類のヌクレオポリン（NUPs）で構成され、その中にはフェニルアラニンーグリシン（FG）リピート配列を持つ特定のNUPs（FG-NUPs）が含まれます。これらのFGリピート配列は固定された構造を持たずFGリピートを介した分子間相互作用が相分離を駆動し、核膜孔内部に液滴を形成します。核膜孔の周辺（核膜孔テリトリー）では、NPCと核膜を支えるラミンタンパク質が協調して、遺伝子の選択的なサイレンシングや活性化が調節されます。核膜孔テリトリーに特有のクロマチン構造や機能が明らかにされつつありますが、NPCやラミンとの相互作用によるDNA自体の物性や構造変化ダイナミクスについてはまだ解明されていません。このため、本研究では、核膜テリトリーにおけるタンパク質ーDNA相互作用とDNAナノ動態を解析するための研究ツールを開発し、ゲノムモダリティの階層的変化をナノスケールで理解することを目指しています。今年度は、NPC-DNA相互作用が実際に起こる核膜孔テリトリーの一部であるNUP153の天然変性領域による相分離を介した相互作用タンパク質を同定し、そのプロファイリングを進めています。さらに、ラミンが作用するゲノム領域についてChIP解析を行い、NUP153が作用するゲノム領域との比較を行っています。また、高速原間力顕微鏡を用いてNUP153 FG-DNAコンフォメーションの変化や弾性率を測定するための条件検討も行っています。2023年に我々の研究成果については、Cells, JPCL, Nano Letters誌に発表した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

核膜孔テリトリーにおいて、核膜孔複合体（NPC）とDNAの相互作用が実際に起こる部位のうち、NUP153の天然変性領域による相分離を介した相互作用タンパク質を特定し、それに関する論文投稿を行った結果、研究は順調に進んでいると判断しました。

今後の研究の推進方策

現在の研究は概ね順調に進行しており、引き続きこれらの研究を継続し、できる限り早期に研究成果を論文として発表することを目指しています。以下に、具体的な研究計画とその進行状況について説明します。
まず核膜孔タンパク質変化が引き起こす液滴動態とその機能変化を明らかにする。測定の調整条件(用いる緩衝液や塩濃度、pHなど)について検討する。次いで、FG-NUPsの修飾変化と相分離形成能力の関連を明らかにするために、翻訳後修飾を受けるアミノ酸の変異リコンビナントタンパク質を作製し、in vitro（液滴アッセイ）、開発した蛍光プローブによる粘性・極性の解析、 in cell 液－液相分離の評価（フォトブリーチング）を行う。高速AFM（HS-AFM）を用いて、FG-NUPsの凝集反応の動的観察を行います。これにより、FG-NUPsがどのようにして液滴を形成するかをリアルタイムで可視化します。キモグラフィック解析を通じて、FG-NUPsの密度動態を評価します。これにより、FG-NUPsが形成する液滴の動的可塑性についても明らかにすることを目指しています。 現在、ある程度まとまったデータが取得できているため、その解析と整理を進めています。これにより、早期に研究成果を論文として発表することを目指しています。
研究の進行は順調であり、これらの計画を着実に実行することで、核膜孔タンパク質の機能と液滴動態の関係性についての理解を深め、生命現象の中核である選択的核膜孔複合体（NPC）とDNAの相互作用のメカニズムを明らかにすることが期待されます。

研究成果

• [雑誌論文] Crafty mimicry grants nuclear pore entry to HIV (2024)
  • 著者名/発表者名: Lim Keesiang、Hazawa Masaharu、Wong Richard W.
  • 雑誌名: Cell Host & Microbe 巻: 32 号: 4 ページ: 441-442
  • DOI: 10.1016/j.chom.2024.03.004
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] An Efficient Method for Isolating and Purifying Nuclei from Mice Brain for Single-Molecule Imaging Using High-Speed Atomic Force Microscopy (2024)
  • 著者名/発表者名: Qiu Yujia、Sajidah Elma Sakinatus、Kondo Sota、Narimatsu Shinnosuke、Sandira Muhammad Isman、Higashiguchi Yoshiki、Nishide Goro、Taoka Azuma、Hazawa Masaharu、Inaba Yuka、Inoue Hiroshiら
  • 雑誌名: Cells 巻: 13 号: 3 ページ: 279-279
  • DOI: 10.3390/cells13030279
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Super-enhancer trapping by the nuclear pore via intrinsically disordered regions of proteins in squamous cell carcinoma cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Hazawa M, Ikliptikawati DK, Iwashima Y, Lin DC, Jiang Y, Qiu Y, Makiyama K, Matsumoto K, Kobayashi A, Nishide G, Keesiang L, Yoshino H, Minamoto T, Suzuki T, Kobayashi I, Meguro-Horike M, Jiang YY, Nishiuchi T, Konno H, Koeffler HP, Hosomichi K, Tajima A, Horike SI, Wong RW.
  • 雑誌名: Cell Chemical Biology 巻: － 号: 4 ページ: 792-804.e7
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2023.10.005
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cell-compatible isotonic freezing media enabled by thermo-responsive osmolyte-adsorption/exclusion polymer matrices (2023)
  • 著者名/発表者名: Kato Yui、Matsuda Yuya、Uto Takuya、Tanaka Daisuke、Ishibashi Kojiro、Ishizaki Takeru、Ohta Akio、Kobayashi Akiko、Hazawa Masaharu、Wong Richard W.、Ninomiya Kazuaki、Takahashi Kenji、Hirata Eishu、Kuroda Kosuke
  • 雑誌名: Communications Chemistry 巻: 6 号: 1 ページ: 260-260
  • DOI: 10.1038/s42004-023-01061-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Chiral and nematic phases of flexible active filaments (2023)
  • 著者名/発表者名: Dunajova Zuzana、Mateu Batirtze Prats、Radler Philipp、Lim Keesiang、Brandis Dorte、Velicky Philipp、Danzl Johann Georg、Wong Richard W.、Elgeti Jens、Hannezo Edouard、Loose Martin
  • 雑誌名: Nature Physics 巻: 19 号: 12 ページ: 1916-1926
  • DOI: 10.1038/s41567-023-02218-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Nanoscopic Elucidation of Spontaneous Self-Assembly of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Open Reading Frame 6 (ORF6) Protein (2023)
  • 著者名/発表者名: Nishide Goro、Lim Keesiang、Tamura Maiki、Kobayashi Akiko、Zhao Qingci、Hazawa Masaharu、Ando Toshio、Nishida Noritaka、Wong Richard W.
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry Letters 巻: 14 号: 38 ページ: 8385-8396
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.3c01440
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Nuclear transport surveillance of p53 by nuclear pores in glioblastoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Ikliptikawati Dini Kurnia、Hirai Nozomi、Makiyama Kei、Sabit Hemragul、Kinoshita Masashi、Matsumoto Koki、Lim Keesiang、Meguro-Horike Makiko、Horike Shin-ichi、Hazawa Masaharu、Nakada Mitsutoshi、Wong Richard W.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 42 号: 8 ページ: 112882-112882
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112882
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Nanoscopic Assessment of Anti-SARS-CoV-2 Spike Neutralizing Antibody Using High-Speed AFM. (2023)
  • 著者名/発表者名: Keesiang Lim, Goro Nishide, Elma Sakinatus Sajidah, Tomoyoshi Yamano, Yujia Qiu, Takeshi Yoshida, Akiko Kobayashi, Masaharu Hazawa, Toshio Ando, Rikinari Hanayama, Richard W Wong
  • 雑誌名: Nano letters 巻: 23 号: 2 ページ: 619-628
  • DOI: 10.1021/acs.nanolett.2c04270
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Nano imaging of genomic modality in nuclear pore territories (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: The 4th “Genome Modality” Annual meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Nano-imaging of the SARS-CoV-2 virus invasion path towards to the nuclear pore (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: The 20th International Microscopy Congress
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 宿主の核膜孔輸送系をウィルスが乗っ取る仕組みをナノスケールで解明 (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: 第96回日本生化学会大会シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Nano assessment of how viruses hijack host nuclear transport systems (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: 学術変革領域A クロススケール新生物学 第3回領域会議
  • 招待講演
• [学会発表] Nano assessment of how viruses hijack the host nuclear pore (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: 第23回日本蛋白質科学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Nano assessment of how viruses seize host nuclear transport systems (2023)
  • 著者名/発表者名: Richard Wong
  • 学会等名: 新学術創成研究機構ワークショップ（栄養・代謝研究ユニット・セルバイオノミクスユニット）
  • 招待講演