• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 前のページに戻る

多コピー生物のアイソフォームと酵素近接性に注目した生合成反応効率の変動予測

公募研究

研究領域生体反応の集積・予知・創出を基盤としたシステム生物合成科学
研究課題/領域番号 23H04539
研究種目

学術変革領域研究(A)

配分区分補助金
審査区分 学術変革領域研究区分(Ⅱ)
研究機関東北大学

研究代表者

長 由扶子  東北大学, 農学研究科, 助教 (60323086)

研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2024年度)
配分額 *注記
8,450千円 (直接経費: 6,500千円、間接経費: 1,950千円)
2024年度: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
キーワード生合成 / 安定同位体 / 代謝フラックス / in vivo標識 / 細胞内局在 / サキシトキシン / 代謝 / 酵素 / LC-MS / 海洋毒 / アイソフォーム
研究開始時の研究の概要

サキシトキシン(STX)及び類縁体による麻痺性貝中毒は過去33年間の海産物毒による世界中の中毒事例のうち最も多い35%を占め、深刻な問題となっている。気候変動に伴うリスク軽減には真の生産者である渦鞭毛藻におけるSTX生合成と代謝の理解が不可欠である。
本研究では1. 多コピー生物であるSTX生産渦鞭毛藻ゲノムのロングリード次世代シークエンス解析、2. 生合成酵素アイソフォームの発現タイミング及び近接性の変動解析、3. STX生合成関連化合物の代謝フラックス解析によって得られるデータを用いて、渦鞭毛藻をとりまく環境の変動に応じたSTX生合成反応効率の変動を予測することを目的としている。

研究実績の概要

ゲノムが巨大で遺伝子が多コピー存在する麻痺性貝毒生産渦鞭毛藻の毒性変動予測に必要な基盤情報として、以下の点に注目して解析した。
1.多コピー生物であるサキシトキシン(STX)生産渦鞭毛藻ゲノムの次世代シークエンス解析:Alexandrium属渦鞭毛藻の麻痺性貝毒生産株のシングルセルのマイクロカプセル化の手法を検討し、多置換増幅法によりシングルセルのDNA増幅が可能であることを示した。増幅されたDNAから渦鞭毛藻のSTX生合成遺伝子sxtAの部分配列をPCRで増幅することができた。ただし増幅効率が低いことが課題であることがわかった。
2.株間及び細胞間多様性の解析:イントロンの存在が報告されていたSTX生合成酵素の遺伝子sxtGの全長をAlexandrium属麻痺性貝毒生産株のゲノムからPCRで増幅してロングアンプリコン解析(次世代シークエンス解析)した。20種の遺伝子バリアントの存在を見出し、5'及び3'非翻訳領域、イントロン、翻訳領域すべてに変異があることが明らかとなった。
3.生合成酵素アイソフォームの機能解析:SxtGのデータベースにあったmRNA配列から合成した遺伝子で小麦胚芽セルフリーたんぱく質合成によってSxtGたんぱく質を得た。In vitro変換反応に供し、わずかに活性がみられたが再現性に乏しかった。
4.生合成酵素間距離と活性の相関解析のための経時変化の解析:生合成酵素SxtGが葉緑体に局在することを示唆する結果を得た。代謝フラックス解析と免疫染色のデータの相関解析により、初期生合成酵素2種が細胞周期と連動して特異的に翻訳調節されている可能性を見出した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通りの実験を実施することができ、基盤情報が得られた。すなわち従来解析されたことのない麻痺性貝毒の代謝フラックスと生合成酵素の発現及び局在の変動を解析する手法を開発し、たしかに変動があることが、実験的に証明された。また、既報では株内にバリエーションがないとされていた麻痺性貝毒生産株の遺伝子バリアントを見出すことに成功した。ただし機能解析のためのセルフリーたんぱく質合成で得られたSxtGの活性が低く、再現性が得られなかったためおおむね順調とした。

今後の研究の推進方策

1.多コピー生物であるSTX生産渦鞭毛藻ゲノムの次世代シークエンス解析:1-1.渦鞭毛藻シングルセルのマイクロカプセル化と多置換増幅(MDA)法により渦鞭毛藻のDNA増幅されたシングルセルが見出されたが、増幅効率が低かったため、次年度は条件をさらに改良して増幅効率の向上をはかり、微小細胞シングルセルからのMDA増幅産物からライブラリを作成してNGS解析に供する。
2.株間及び細胞間多様性の解析:2-1. 見出したsxtG遺伝子バリアントの多様性が一般的なものなのかを調べるため、他の株のゲノムを複数解析する。2-2.細胞内のコピーごとのバリアントなのか、細胞ごとにバリアントの組成が異なるのかを1.で調製したシングルセルからのMDA増幅DNAのロングアンプリコン解析によって調べる。
3.生合成酵素アイソフォームの機能解析:3-1.ゲノムからロングアンプリコン解析により得られた20種のsxtG遺伝子バリアントがmRNAとして転写されているか調べるため、sxtG遺伝子の転写が活発な時期にRNAを抽出して同様な解析を実施する。3-2.上記より得られた配列から合成タンパク質を得て、in vitro反応により活性の強弱を比較する。
4.生合成酵素の酵素間距離の変動と反応性の相関解析:代謝フラックス解析と免疫染色のデータの相関解析により、初期STX生合成酵素2種が細胞周期と連動してS期に特異的に翻訳調節されている可能性があることがわかった。生合成酵素2種(SxtA及びSxtG)の在の異なる細胞も観察されたが、同調化していなかったため、それがS期の時期による変動なのか、細胞の活性化状態の違いによるのかわからなかった。そこでS期に細胞周期を停止させることがわかっている代謝阻害剤マイトマイシンCを添加してS期に停止しつつある段階から停止するまでの細胞を含む状態で生合成酵素2種(SxtA及びSxtG)の酵素間距離を超解像顕微鏡観察により調べ、代謝フラックスの変動との相関を調べる。

報告書

(1件)
  • 2023 実績報告書
  • 研究成果

    (17件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (16件) (うち国際学会 8件、 招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Synthesis and Identification of decarbamoyloxySaxitoxins in Toxic Microalgae and their Reactions with the Oxygenase, SxtT, Reveal Saxitoxin Biosynthesis2024

    • 著者名/発表者名
      Hakamada Mayu、Tokairin Chihiro、Ishizuka Hayate、Adachi Kanna、Osawa Toma、Aonuma Shiori、Hirozumi Ryosuke、Tsuchiya Shigeki、Cho Yuko、Kudo Yuta、Konoki Keiichi、Oshima Yasukatsu、Nagasawa Kazuo、Yotsu‐Yamashita Mari
    • 雑誌名

      Chemistry A European Journal

      巻: 30 号: 18

    • DOI

      10.1002/chem.202304238

    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 藍藻Dolichospermum circinale由来のサキシトキシン生合成酵素SxtTの大腸菌での発現と反応2024

    • 著者名/発表者名
      山下まり・青沼栞里・工藤雄大・ 袴田真有・廣住燎亮・長 由扶子・此木敬一・ 石塚 颯・長澤和夫
    • 学会等名
      令和6年度 日本水産学会 春季大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] Alexandrium catenella (Group I)有毒株Axat-2におけるサキシトキシン生合成遺伝子sxtGの株内多様性解析2024

    • 著者名/発表者名
      長 由扶子 , 大村卓朗 , 此木敬一 , 大島泰克 , 山下まり
    • 学会等名
      令和6年度 日本水産学会 春季大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 麻痺性貝毒サキシトキシンの推定生合成中間体の合成研究(2)2024

    • 著者名/発表者名
      廣住 燎亮 , 長 , 由扶子 , 工藤 雄大 , 此木 敬一 , 長澤 和夫 , 山下 まり
    • 学会等名
      日本農芸化学会2024年度大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] In vivo標識及び免疫染色による渦鞭毛藻サキシトキシン生合成の明暗サイクル内変動解析2024

    • 著者名/発表者名
      長 由扶子 , 土屋 成輝 , 大村 卓朗 , 此木 敬一 , 大島 泰克 , 山下 まり
    • 学会等名
      日本農芸化学会2024年度大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] 麻痺性貝毒サキシトキシンの推定生合成中間体の合成および生合成研究2023

    • 著者名/発表者名
      廣住燎亮 , 長 由扶子 , 工藤雄大 , 此木敬一 , 長澤和夫 , 山下まり
    • 学会等名
      日本農芸化学会東北支部第158回大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] Dynamic analysis of saxitoxin biosynthesis and catabolism in the dinoflagellate, Alexandrium catenella affected by nigericin2023

    • 著者名/発表者名
      Yuko Cho , Shigeki Tsuchiya , Takuo Omura , Keiichi Konoki , Yasukatsu Oshima , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      International Symposium in Okinawa, 2023, on Ciguatera and Related Marine Biotoxins
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Synthetic study of a putative biosynthetic intermediate of the paralytic shellfish toxin, saxitoxin.2023

    • 著者名/発表者名
      Ryosuke Hirozumi , Yuko Cho , Yuta Kudo , Keiichi Konoki , Kazuo Nagasawa , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      International Symposium in Okinawa, 2023, on Ciguatera and Related Marine Biotoxins.
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Colchicine induced dynamic changes in saxitoxin biosynthesis and metabolism in the dinoflagellate Alexandrium pacificum (Group IV)2023

    • 著者名/発表者名
      Yuko Cho , Shigeki Tsuchiya , Takuo Omura , Kazuhiko Koike , Keiichi Konoki , Yasukatsu Oshima , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      20th International Conference on Harmful Algae
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Chemical studies on biosynthetic and metabolic pathways of marine toxins2023

    • 著者名/発表者名
      Mari Yotsu-Yamashita , Yuta Kudo , Shigeki Tsuchiya , Satoshi Numano , Yuko Cho , Keiichi Konoki , Yasukatsu Oshima , Kazuo Nagasawa
    • 学会等名
      20th International Conference on Harmful Algae
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 12β-デオキシ-デカルバモイロキシサキシトキシンの有毒藍藻からの同定2023

    • 著者名/発表者名
      山下まり , 袴田真有 , 石塚颯 , 安達栞菜 , 大澤瞳生 , 長由扶子 , 工藤雄大 , 此木敬一 , 大島泰克 , 長澤和夫
    • 学会等名
      令和5年度日本水産学会秋季大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] ColchicineがSTX生産渦鞭毛藻のアミノ酸生合成に及ぼす影響2023

    • 著者名/発表者名
      長 由扶子 , 小池 一彦 , 此木 敬一 , 大島 泰克 , 山下 まり
    • 学会等名
      令和5年度日本水産学会秋季大会
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
  • [学会発表] Synthetic study of a putative biosynthetic intermediate of the paralytic shellfish toxin, saxitoxin2023

    • 著者名/発表者名
      Ryosuke Hirozumi , Yuko Cho , Yuta Kudo , Keiichi Konoki , Kazuo Nagasawa , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      International Symposium for the 80th Anniversary of the Tohoku Branch of the Chemical Society of Japan 2023 Joint Meeting of the Tohoku Area Chemistry Societies
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Synthesis and identification of decarbamoyloxysaxitoxins in the toxic microalgae for elucidation of saxitoxin biosynthesis2023

    • 著者名/発表者名
      Mayu Hakamada , Chihiro Tokairin , Hayate Ishizuka , Kanna Adachi , Toma Osawa , Ryosuke Hirozumi , Yuko Cho , Yuta Kudo , Keiichi Konoki , Yasukatsu Oshima , Kazuo Nagasawa , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      Tohoku University GP-Chem Chemistry Summer School 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Synthetic study of a putative biosynthetic intermediate of the paralytic shellfish toxin, saxitoxin2023

    • 著者名/発表者名
      Ryosuke Hirozumi , Yuko Cho , Yuta Kudo , Keiichi Konoki , Kazuo Nagasawa , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      Tohoku University GP-Chem Chemistry Summer School 2023
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] H+/K+ Ionophore, nigericin reduces saxitoxin biosynthesis and enhances its metabolism in the dinoflagellate, Alexandrium catenella (Group I)2023

    • 著者名/発表者名
      Yuko Cho , Shigeki Tsuchiya , Takuo Omura , Keiichi Konoki , Yasukatsu Oshima , Mari Yotsu-Yamashita
    • 学会等名
      ゴードン会議, Mycotoxins and Phycotoxins
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 多コピー生物のアイソフォームと酵素近接性に注目した生合成反応効率の変動予測2023

    • 著者名/発表者名
      長 由扶子、土屋 成輝、大村 卓朗、小池 一彦、此木 敬一、大島 泰克、山下 まり
    • 学会等名
      学術変革領域研究(A)令和 4 年度~8 年度 生体反応の集積・予知・創出を基盤としたシステム生物合成科学 ~予知生合成科学~第2回公開シ ンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実績報告書
    • 招待講演

URL: 

公開日: 2023-04-13   更新日: 2024-12-25  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi