公募研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
本研究では、細胞と同程度の大きさを有する物理的空間を人工的に作り出し（フェムトリットル空間）、その中で生じる酵素反応のカイネティクスを解析することでin vivoにおける分子クラウディング効果の再現と検証を行った。これまでに再現性などの問題があった実験系を改善することで、フェムトリットル空間における各種パラメータを取得するとともに、単一の核を扱った研究へ応用するなど、新しい研究への展開を図った。これまでβ-galの基質としてFDG（di-O-β-galactoside）を用いて酵素反応速度の測定を行ってきたが、これにはいくつかの問題点があった。ひとつはFDGがβ-galにより加水分解されてFluoresceinが生成する過程は2段階反応であり、中間体であるFMG（mono-O-β-galactoside）もわずかではあるが蛍光を発すること、また2段階反応であるため、Fluoresceinの生成に時間がかかることなどがあった。そこで、基質をFDGからTG-βGal（2-Me-4-OMe TokyoGreen O-β-galactoside）に変更することとした結果、酵素反応測定5分程度でも、十分な蛍光強度すなわち最大の酵素反応速度に達したため、これまでよりも精度の高い測定が可能となった。バルク系の実験としては、これまでは分子クラウディング剤としてPEG8000やPEG20000などを用いてきたが、Ficoll（平均分子量400）を用いて酵素反応速度への影響についても検討を行い、PEGを用いた際のような顕著な代謝回転数Vmaxの低下やミカエリス定数KMの増加といった傾向は見られなかった。このことからも、PEGそのものが水の活性に影響を与えることで酵素活性に間接的に影響を与えていることを明らかとした。
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 2件) 図書 (3件)
Annual review of analytical chemistry
巻: (印刷中) 号: 1 ページ: 83-96
10.1146/annurev-anchem-062012-092619
化学と工業
巻: 9 ページ: 65-69
10031031949
現代化学
巻: 502 ページ: 50-54
