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1分子観測によるGタンパク質共役型受容体の二状態モデルの検討

公募研究

研究領域過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解-生理的準安定状態を捉える新技術-
研究課題/領域番号 24121716
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関京都大学

研究代表者

七田 芳則  京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (60127090)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2014-03-31
研究課題ステータス 完了 (2013年度)
配分額 *注記
11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円)
2013年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2012年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
キーワード構造変化 / ロドプシン / 蛍光プローブ / 平衡 / 過渡的複合体 / ダイナミクス
研究概要

交付申請書に記載の研究計画に沿って、以下の実験を行った。
①我々はCys316を蛍光色素Alexaでラベルした天然ロドプシンを実験材料にして、1分子レベルでのロドプシンの構造変化を解析し、リガンドの違いや有無により構造変化のダイナミクスが異なることを明らかにした。そこで、本年は同様の構造変化がアミノ酸変異を加えたロドプシンでも観測されるかを検討した。前年度までに確立した方法を用いて、培養細胞系で発現させたロドプシンの構成的活性変異体(M257Y)をAlexaでラベルし、1分子解析した。その結果、M257Yでは、暗状態(インバースアゴニスト結合状態)での活性構造の生成は抑制されているが、リガンドと結合していない状態での活性構造の生成頻度が、野生型に比べて大幅に上昇していることが示された。これは、活性構造と不活性構造との間の平衡が、変異によって前者にシフトしたことを示唆しており、ロドプシンの構成的活性変異体でも二状態モデルで説明できることがわかった。
②24年度は蛍光ラベルしたGタンパク質のC末端ペプチドと、別の蛍光色素でラベルしたロドプシンの活性状態との過渡的複合体形成を1分子FRETで観測することを試みた。しかし、1分子計測の系では試料濃度が希薄なため、結合を観測するまでには至らなかった。そこで、本年度はロドプシンのC末端部にGタンパク質のC末端ペプチドを結合させた融合蛋白質を数種類設計し、C末端ペプチドがロドプシン部分に効率よく結合するコンストラクトを検討した。その結果、高親和配列を含んだGタンパク質のC末端20残基を融合させると、この部位がメタ中間体に結合し、平衡が活性構造(Meta-II)にシフトすることが示された。今後は、ロドプシン部分とGタンパク質部分を別々の蛍光色素でラベルして一分子計測することにより、構造揺らぎとGタンパク質結合能の相関を検討する。

現在までの達成度 (区分)
理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

報告書

(2件)
  • 2013 実績報告書
  • 2012 実績報告書
  • 研究成果

    (12件)

すべて 2014 2013 2012

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Ligand-induced population shift leads to the activation of rhodopsin, a G-protein coupled receptor2014

    • 著者名/発表者名
      Maeda, R., Hiroshima, M., Yamashita, T., Wada, A., Nishimura, S., Sako, Y., Shichida, Y., and Imamoto, Y
    • 雑誌名

      Biophys. J

      巻: 106 (4) 号: 4 ページ: 915-924

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2014.01.020

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Rod visual pigment optimizes active state to achieve efficient G protein activation as compared to cone visual pigments2014

    • 著者名/発表者名
      Kojima, K., Imamoto, Y., Maeda, R., Yamashita, T., and Shichida, Y
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem

      巻: 289 (8) 号: 8 ページ: 5061-5073

    • DOI

      10.1074/jbc.m113.508507

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cone visual pigments.2013

    • 著者名/発表者名
      Imamoto Y, Shichida Y
    • 雑誌名

      Biochim Biophys Acta.

      巻: 1873(5) 号: 5 ページ: 3010-3018

    • DOI

      10.1016/j.bbabio.2013.08.009

    • NAID

      120005439157

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] The C-terminus of the G protein α subunit controls the affinity of nucleotides.2012

    • 著者名/発表者名
      Kimata, N.
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 51 ページ: 2768-2774

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Spectroscopic analysis of the effect of chloride on the active intermediates of the primate L group cone visual pigment.2012

    • 著者名/発表者名
      Morizumi, T.
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 51 ページ: 10017-23

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Comparative studies on the late bleaching processes of four kinds of cone visual pigments and rod visual pigment.2012

    • 著者名/発表者名
      Sato, K.
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 51 ページ: 4300-4308

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Molecular properties and functional diversity of rod and cone visual pigments2013

    • 著者名/発表者名
      Y. Shichida
    • 学会等名
      8th Asian Biophysics Association
    • 発表場所
      Jeju, Korea
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Gタンパク質共役型受容体の構造的活性変異体に見られるGタンパク質活性化メカニズムの一分子解析2013

    • 著者名/発表者名
      R. Maeda, M. Hiroshima, Y. Imamoto , T. Yamashita, Y. Sako,Y. Shichida
    • 学会等名
      日本生物物理学会第51回年会
    • 発表場所
      京都
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Rod visual pigment optimizes active state to achieve efficient G protein activation as compared to cone visual pigments2013

    • 著者名/発表者名
      K. Kojima, Y. Imamoto, R. Maeda, T. Yamashita,Y. Shichida
    • 学会等名
      The 6th Asia & Oceania Conference on Photobiology
    • 発表場所
      Sydney, Australia
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Direct monitoring of conformational equilibria in single rhodopsin molecule2013

    • 著者名/発表者名
      R. Maeda, M. Hiroshima, Y. Imamoto , Y. Sako,Y. Shichida
    • 学会等名
      The 6th Asia & Oceania Conference on Photobiology
    • 発表場所
      Sydney, Australia
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Comparative analysis of transducin activation by rhodopsin and cone pigments in nanodiscs2012

    • 著者名/発表者名
      Kojima, K.
    • 学会等名
      日本生物物理学会第50回年会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      2012-09-22
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] ロドプシン活性化の一分子計測2012

    • 著者名/発表者名
      前田亮
    • 学会等名
      日本光生物学協会年会
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2012-08-17
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書

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公開日: 2013-05-15   更新日: 2019-07-29  

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