| 研究領域 | 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－ |
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| 研究課題/領域番号 |
24121717
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
複合領域
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
森井 孝 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2013年度)
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| 配分額 *注記 |
11,310千円 (直接経費: 8,700千円、間接経費: 2,610千円)
2013年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
2012年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | ﾊﾞｲｵセンター / イノシトールポリリン酸 / 単一細胞 / PHドメイン / リアルタイム計測 / バイオセンサー |
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| 研究概要 |
(1) 細胞膜でのフォスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）濃度変化を蛍光により計測
細胞内で発現できるPIP3センサーの土台として、イノシトール四リン酸（IP4）との特異的な結合に依存して構造がわずかながら変化することがX線結晶構造解析から明らかになっているGRP1-PHドメインを用いた。PHドメインの構造情報に基づきcpGFP (circularly permuted GFP)のPHドメインへの融合可能な位置及びPIP3もしくはIP4の結合により構造変化する領域を評価し、構造変化の大きなループ部位でPHドメインを分割し（Split PHドメイン）、融合する位置及びリンカー長を変え、cpGFPを挿入した。円順列変異を施した蛍光性タンパク質cpGFPとリセプターとしてSplit化したGRP1-PHドメインを融合させたバイオセンサーは、IP4濃度変化に対して応答することを細胞外で確認した。
(2) 種類の異なるイノシトールポリリン酸濃度変化を単一細胞内で同時計測
カルシウムセンサーとイノシトール三リン酸（IP3）センサー、カルシウムセンサーとIP4センサーを導入したHeLa細胞において、それぞれカルシウム濃度とIP3濃度、カルシウム濃度とIP4濃度のヒスタミン刺激による時間的・空間的濃度変化を単一細胞内で同時にリアルタイムで計測する手法を確立した。IP3キナーゼの阻害剤として知られている小分子を用いて、単一細胞内でアゴニスト刺激に応じたカルシウムイオンとIP3 、IP4の動態を解析したところ、細胞内においてカルシウムイオン濃度が周期的に変動する「オシレーション」の発現にはIP3産生だけでなくIP4産生もまた重要な役割を果たすことが明らかになった。本手法が単一細胞内イノシトールリン酸類濃度変化を制御する小分子のスクリーニングを行ううえでの有用性を実証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
理由
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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