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In situ膜蛋白質間相互作用NMR検出技術

公募研究

研究領域過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解-生理的準安定状態を捉える新技術-
研究課題/領域番号 24121719
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

配分区分補助金
審査区分 複合領域
研究機関大阪大学

研究代表者

児嶋 長次郎  大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (50333563)

研究期間 (年度) 2012
研究課題ステータス 中途終了 (2012年度)
配分額 *注記
5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2012年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
キーワードNMR / 構造生物学 / 膜蛋白質
研究概要

動的複合体状態は生命現象を理解する上で極めて重要であるが、原子レベル精度でそれらを解析するのは未だに困難である。特に膜蛋白質では足場としての膜自身の役割が大きく、in situでの動的複合体の解析が必須と考えられる。そこで本研究では膜蛋白質複合体を生きている細胞のまま原子レベル精度で解析可能なNMR技術を開発する。具体的には、生きている大腸菌で相互作用を観測したい膜蛋白質のみを安定同位体標識する技術を開発し、生きている細胞へDNP法を適用して測定感度を大幅向上させることで、in situで膜蛋白質問の動的相互作用を原子レベル精度で解析する。
平成24年度は、生きている大腸菌で相互作用を観測したい膜蛋白質のみを安定同位体標識する技術を開発した。生きている細胞のまま膜蛋白質を検出するには、生きている細胞に安定同位体を取り込ませ、膜蛋白質のみを安定同位体標識する技術が不可欠である。そこで2回膜貫通型蛋白質pHtrIIの大腸菌大量発現系において、培養時に非標識培地を、誘導時に安定同位体標識培地を用いることで、観測したい膜蛋白質のみを安定同位体標識することとした。従来法では,バックグラウンドとなる大腸菌由来の目的膜蛋白質以外のNMR信号が検出され、大きな問題となっていた。そこで、バックグラウンドとなる目的蛋白質以外の新規蛋白質合成を完全に阻害することが可能な大菌のSPPシステムを用いることで、目的膜蛋白質のみを安定同位体標識することに成功し、生きている大腸菌での観測にも成功した。

報告書

(1件)
  • 2012 実績報告書
  • 研究成果

    (4件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Utilization of lysine ^<13>C-methylation NMR for protein-protein interaction studies2013

    • 著者名/発表者名
      Yoshikazu Hattori
    • 雑誌名

      Journal of Biomolecular NMR

      巻: 55(In pres)

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Insights into substrate recognition by the E. coli orf135 protein through its solution structure2012

    • 著者名/発表者名
      Kumiko Kawasaki
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun.

      巻: 420 号: 2 ページ: 263-268

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2012.02.146

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] ¹H, ¹³C and ¹⁵N NMR assignments of the Escherichia coli Orf135 protein.2012

    • 著者名/発表者名
      Kumiko Kawasaki
    • 雑誌名

      Biomol NMR Assign.

      巻: 6 号: 1 ページ: 1-4

    • DOI

      10.1007/s12104-011-9312-7

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 固体NMR法を用いた生理的環境での膜蛋白質pHtrIIの構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      江川文子
    • 学会等名
      第51回NMR討論会
    • 発表場所
      ウインクあいち(名古屋市)(招待講演)
    • 年月日
      2012-11-10
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書

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公開日: 2013-05-31   更新日: 2019-07-29  

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